【技术实现步骤摘要】
本申请属于动物模型，具体涉及一种spem2基因点突变小鼠模型的构建方法、试剂盒及其应用。
技术介绍
1、临床上把男性不育分为性功能障碍和性功能正常两类，后者依据精液分析结果可进一步分为无精子症、少精子症、弱精子症、精子无力症和精子数正常性不育。模拟男性不育患者突变构建的相关基因敲除/敲入小鼠模型在男性不育相关基因的功能与致病机制探究中发挥了重要作用，能够借助模型小鼠探究该基因在精子发生过程中的作用，研究该基因表达异常对精子发生的影响，并可以借助相关技术手段对小鼠进行实验模拟不育表型，探究模型小鼠的辅助助孕结果，对于患者的诊断和辅助生殖助孕治疗具有重要的参考和应用价值。
技术实现思路
1、基于此，本申请一实施例提供一种可用于研究男性患者的不孕不育的spem2基因点突变小鼠模型的构建方法。
2、本申请一方面提供一种spem2基因点突变小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：
3、（1）获取靶向小鼠spem2基因第三号外显子p.r151w位置的sgrna与同源修复模板donor dna；所述sgrna的序列如seq id no.1所示；所述模板donor dna的序列如seq idno.2所示。
4、（2）采用sgrna构建sgrna/cas9表达载体，体外转录，制备mrna。
5、（3）将所述mrna以及所述donor dna引入小鼠受精卵，获得f0代小鼠。
6、（4）从所述f0代小鼠中筛选spem2基因点突变稳定的小鼠遗传系作为阳
7、在其中一个实施例中，采用pcr法筛选阳性f0代小鼠，pcr法筛选时所使用的检测引物如seq id no.3和seq id no.4所示。
8、在其中一个实施例中，pcr法筛选时的扩增的程序为：94℃~96℃条件反应4min~6min，1个循环；93℃~95℃条件反应25s~35s，35个循环；56℃~60℃条件反应28s~32s；70℃~74℃条件反应38s~42s；70℃~74℃条件反应8min~12min，1个循环；3.5℃~4.5℃条件反应55min~65min，1个循环。
9、在其中一个实施例中，小鼠品系选自c57bl/6或dba/2。
10、本申请另一方面还提供一种构建spem2基因点突变小鼠模型的试剂盒，含有sgrna以及对应的引物和同源修复模板donor dna，所述的sgrna序列如seq id no.1所示，所述同源修复模板donor dna的序列如seq id no.2所示。
11、在其中一个实施例中，还包括检测引物对。
12、在其中一个实施例中，所述检测引物对的序列如seq id no.3和seq id no.4所示。
13、在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括cas9 mrna。
14、在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括taq dna聚合酶、dntps和mg2+中的一种或多种。
15、本申请另一方面提供上述的构建方法或上述的试剂盒制得的spem2基因点突变小鼠模型在药物筛选中的应用。
16、在其中一个实施例中，所述药物包括治疗精子发生障碍的药物。
17、相对于传统技术，本申请的有益效果包括：
18、本申请通过研究发现，spem2基因第三号外显子上的该突变p.r151w（aga totgg），能够模拟患者所携带的突变位点。由于spem2基因在人和小鼠中均为睾丸特异性表达的基因之一，从而构建出了有效的能够模拟患者所携带的spem2突变位点的小鼠模型。
19、该模型的建立对于深入分析该突变的致病性，研究spem2基因的具体功能，探讨相关的致病机制，并为临床上该类基因缺陷患者的治疗提供理论基础等方面具有重要意义。
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1.一种Spem2基因点突变模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的Spem2基因点突变小鼠模型的构建方法，其特征在于，采用PCR法筛选阳性F0代小鼠，PCR法筛选时所使用的检测引物如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
3.根据权利要求1所述的Spem2基因点突变小鼠模型的构建方法，其特征在于，PCR法筛选时的扩增的程序为：94℃~96℃条件反应4min~6min，1个循环；93℃~95℃条件反应25s~35s，35个循环；56℃~60℃条件反应28s~32s；70℃~74℃条件反应38s~42s；70℃~74℃条件反应8min~12min，1个循环；3.5℃~4.5℃条件反应55min~65min，1个循环。
4.根据权利要求1~3任一项所述的Spem2基因点突变小鼠模型的构建方法，其特征在于，小鼠的品系选自C57BL/6或DBA/2。
5.一种构建Spem2基因点突变小鼠模型的试剂盒，其特征在于，含有sgRNA以及同源修复模板Donor DNA，所述sgRNA的序列如SEQ ID N
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还包括用于筛选阳性F0代小鼠的检测引物对；
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括Cas9 mRNA。
8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括Taq DNA聚合酶、dNTPs和Mg2+中的一种或多种。
9.权利要求1~4任一项所述的构建方法或权利要求5~8任一项所述的试剂盒制得的Spem2基因点突变小鼠模型在药物筛选中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述药物包括治疗精子发生障碍的药物。
...【技术特征摘要】
1.一种spem2基因点突变模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的spem2基因点突变小鼠模型的构建方法，其特征在于，采用pcr法筛选阳性f0代小鼠，pcr法筛选时所使用的检测引物如seq id no.3和seq id no.4所示。
3.根据权利要求1所述的spem2基因点突变小鼠模型的构建方法，其特征在于，pcr法筛选时的扩增的程序为：94℃~96℃条件反应4min~6min，1个循环；93℃~95℃条件反应25s~35s，35个循环；56℃~60℃条件反应28s~32s；70℃~74℃条件反应38s~42s；70℃~74℃条件反应8min~12min，1个循环；3.5℃~4.5℃条件反应55min~65min，1个循环。
4.根据权利要求1~3任一项所述的spem2基因点突变小鼠模型的构建方法，其特征在于，小鼠的品系选自c57bl/6或...
【专利技术属性】
技术研发人员：李永，谭跃球，涂超峰，蒙岚岚，何文斌，王韦力，胡童谣，谢春波，卢文庆，林戈，卢光琇，
申请(专利权)人：中信湘雅生殖与遗传专科医院有限公司，
类型：发明
国别省市：
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