【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及蛋白分析检测领域，具体涉及一种血浆β-淀粉样蛋白检测方法。
技术介绍
1、阿尔茨海默病(alzheimer’s disease，ad)是一种进行性、不可逆的神经退行性疾病，是导致老年期痴呆的主要原因。脑内β-淀粉样蛋白(β-amyloid，aβ)沉积是ad的主要病理特征之一，通常发生于患者进展为痴呆的十到二十年之前，被认为是体内能够最早反映ad神经病理学改变的证据。aβ是由淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，app)经β-分泌酶和γ-分泌酶不断剪切形成的长度可变的多肽，其主要亚型为β-淀粉样蛋白40(aβ40)和β-淀粉样蛋白42(aβ42)。通过检测aβ等反映ad病理变化的生物标志物，可以对患者的神经病理学改变进行准确评估，为疾病的准确诊断和早期诊断提供重要信息。目前生物标志物的检测在ad临床诊断中的价值正逐渐受到重视。阿尔茨海默病国际工作组(theinternational working group，iwg)针对ad早期临床诊断的建议就强调了只有当患者同时存在特定的ad临床表现(表型阳性)和ad病理相关生物标志物证据(aβ阳性和tau阳性)时，才能将其诊断为ad。
2、血液生物标志物检测相对于pet和csf检测具有侵入性更小且价格更低的优势，在临床应用方面具有广阔前景。此外，近年来的多项研究表明，血浆中aβ42/aβ40比值与csf和pet检测结果相关，能够高精度地识别aβ沉积的个体，对ad的早期诊断和准确诊断具有重要价值。但目前并不推荐将其用于ad的临床诊断。其中
3、目前血浆aβ42和aβ40的主要检测方法可分为两类：基于抗原抗体特异性反应的免疫检测和基于质谱原理的检测。免疫检测方法主要包括酶联免疫吸附分析(enzyme linkedimmunosorbent assay，elisa)、化学发光分析(chemiluminiscence，cl)和单分子阵列(single-moleculearray，simoa)等，具有操作简便、自动化程度高等优点。然而，其准确性高度依赖于抗体对待测物的特异性识别。不同试剂厂家使用的特异性高亲和力抗体的性能通常存在差异，这导致了不同免疫检测方法的结果不一致。此外，有研究表明，即使是使用了相同抗体的elisa和simoa，其检测结果之间也存在较大差异。质谱(mass spectrometry，ms)是一种测量离子质荷比(质量-电荷比)的技术，同时具备高灵敏度和高选择性的优势，被广泛应用于生物分析领域。由于血浆成分复杂，内源性aβ蛋白的浓度极低，样本在进行质谱检测之前通常需要使用免疫沉淀(immunoprecipitation，ip)前处理进行富集纯化。这种将免疫沉淀与质谱检测结合的分析方法又被称为ip-ms。ip-ms技术能够有效地降低样品复杂度，提高检测灵敏度和特异性，尤其适用于生物样品中低丰度蛋白质的定量检测，已被多家机构和科研单位用于建立血浆aβ蛋白的检测方法。但是，现有的aβ38、aβ40和aβ42利用液相质谱的检测方法，由于在血浆中存在aβ40和aβ42众多结构相似的亚型，现有检测方法对样品的前处理、以及检测标志物的选择易受结构相似的亚型的影响，导致检测方法的特异性不佳，准确度、重复性及灵敏度有待改善。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供血浆β-淀粉样蛋白检测方法。
2、为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种血浆β-淀粉样蛋白检测方法，所述血浆β-淀粉样蛋白检测方法检测的目标物为aβ40蛋白、aβ42蛋白；所述血浆β-淀粉样蛋白检测方法包括以下步骤：
3、(1)将15n-aβ40蛋白和15n-aβ42蛋白作为内标与待测血浆样品混匀，混匀后两种内标的终浓度为80～120pg/ml；将加入内标的待测血浆样品与包被β-淀粉样蛋白n端特异性单克隆抗体的树脂磁珠混合得到混合体系a于25～30℃下孵育2～4小时；
4、(2)去除混合体系a中的液体得到免疫沉淀的树脂磁珠，清洗免疫沉淀的树脂磁珠后对免疫沉淀的树脂磁珠进行洗脱，收集洗脱液；
5、(3)去除步骤(2)得到的洗脱液中的溶剂，用碳酸氢铵溶液复溶后与定量胰蛋白酶混匀后进行酶解反应，加入终止剂终止酶解反应后得到样本a，将样本a除盐得到样本b；
6、(4)将样本b进液相二级质谱仪(lc-ms/ms)检测aβ40蛋白、aβ42蛋白以及作为内标的15n-aβ40蛋白和15n-aβ42蛋白，以样本b中aβ42蛋白和aβ40蛋白的特征肽段在液相二级质谱仪中的信号定量aβ40蛋白、aβ42蛋白，其中aβ40蛋白的特征肽段为肽段gaiiglmvggvv，aβ42蛋白的特征肽段为肽段gaiiglmvggvvia，内标15n-aβ40蛋白和15n-aβ42蛋白特征肽段分别为15n标记的肽段15n-[gaiiglmvggvv]、肽段15n-[gaiiglmvggvvia]，通过选择特征肽段在液相二级质谱仪中的母离子、子离子进行定性和定量，其中肽段gaiiglmvggvv的母离子为1085.64+，15n-[gaiiglmvggvv]的母离子为1097.6+，肽段gaiiglmvggvvia的母离子为635.38++，肽段15n-[gaiiglmvggvvia]的母离子为642.36++；
7、所述肽段gaiiglmvggvv的子离子包括656.38(b7+)、755.45(b8+)、812.47(b9+)、869.49(b10+)和968.56(b11+)，
8、所述肽段15n-[gaiiglmvggvv]的子离子包括663.36(b7+)、763.42(b8+)、821.44(b9+)、879.46(b10+)、979.53(b11+)，
9、所述肽段gaiiglmvggvvia的子离子包括656.38(b7+)、755.45(b8+)、812.47(b9+)、869.49(b10+)、968.56(b11+)、1067.63(b12+)、1180.71(b13+)；
10、所述肽段15n-[gaiiglmvggvvia]的子离子包括663.36(b7+)，763.42(b8+)，821.44(b9+)，879.46(b10+)，979.53(b11+)，1079.59(b12+)，1193.67(b13+)。
11、专利技术人在研究血浆β-淀粉样蛋白检测方法中，通过胰蛋白酶对血浆中的目标物aβ40蛋白、aβ42蛋白酶解，以酶解后的特征肽段，即aβ40蛋白的特征肽段为肽段gly-ala-ile-ile-gly-leu-met-val-gly-gly-val-val(gaiiglmvggvv)，aβ42蛋白的特征肽段为肽段gly-ala-ile-ile-gly-leu-met-val-gly-gly-val-v本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种血浆β-淀粉样蛋白检测方法，其特征在于，所述血浆β-淀粉样蛋白检测方法检测的目标物为Aβ40蛋白、Aβ42蛋白；
2.根据权利要求1所述血浆β-淀粉样蛋白检测方法，其特征在于，所述肽段GAIIGLMVGGVV的定量子离子为968.56（b11+），所述肽段GAIIGLMVGGVV的定性子离子为755.45（b8+），所述肽段GAIIGLMVGGVVIA的定量子离子为1067.63（b12+），所述肽段GAIIGLMVGGVVIA的定性子离子为968.56（b11+）。
3.根据权利要求1所述血浆β-淀粉样蛋白检测方法，其特征在于，所述步骤（3）中胰蛋白酶的用量为：胰蛋白酶的质量与步骤（1）中树脂磁珠的质量比例为1：（200~2000），步骤（3）中酶解的时间为12~16小时，步骤（3）中用于复溶的碳酸氢氨的溶液的浓度为80~120mM，体积为50~300 μL，步骤（3）中的终止剂为甲酸。
4.根据权利要求1所述血浆β-淀粉样蛋白检测方法，其特征在于，所述步骤（1）中所述树脂磁珠为M270环氧树脂磁珠，所述待测血浆样品与M270环氧树脂
5.根据权利要求4所述血浆β-淀粉样蛋白检测方法，其特征在于，所述包被β-淀粉样蛋白N端特异性单克隆抗体的M270环氧树脂磁珠的制备方法包括以下步骤：
6.根据权利要求1所述血浆β-淀粉样蛋白检测方法，其特征在于，所述步骤（1）中，包被β-淀粉样蛋白N端特异性单克隆抗体的树脂磁珠与加入内标的待测血浆样品的比例为0.8~1.2mg包被β-淀粉样蛋白N端特异性单克隆抗体的树脂磁珠比1mL加入内标的待测血浆样品，所述步骤（2）中的洗脱液为甲酸水溶液和乙腈的混合液，其中，甲酸水溶液和乙腈的体积比为（0.8~1.2）：1，甲酸水溶液的质量浓度为1.8~2.2%。
7.根据权利要求1所述血浆β-淀粉样蛋白检测方法，其特征在于，所述步骤（4）中，液相二级质谱仪检测的液相色谱条件包括：
8.根据权利要求7所述血浆β-淀粉样蛋白检测方法，其特征在于，所述步骤（4）中，液相二级质谱仪检测的液相色谱条件包括：
9.根据权利要求1所述血浆β-淀粉样蛋白检测方法，其特征在于，所述步骤（4）中，液相二级质谱仪检测的质谱条件包括：用于肽段GAIIGLMVGGVVIA检测的锥孔电压为20 V，碰撞电压为15 V；用于肽段GAIIGLMVGGVV检测的锥孔电压为20 V，碰撞电压为28 V，毛细管电压设置为2.7 kV、去溶剂温度设置为650 ℃、去溶剂气流设置为1200 L/Hr、锥孔气流设置为150 L/Hr。
10.根据权利要求1所述血浆β-淀粉样蛋白检测方法，其特征在于，所述步骤（3）中，将样本a除盐得到样本b的方法为：用活化、平衡后的C18 SPE柱，将样本a过C18 SPE柱，用冲洗液冲洗C18 SPE柱，然后用洗脱液洗脱C18 SPE柱并收集洗脱C18 SPE柱后的滤液得到样本b，其中冲洗液为体积分数95%的质量浓度0.1%的三氟乙酸水溶液与体积分数5%甲醇的混合液，洗脱液为体积分数20%的质量浓度0.1%的三氟乙酸水溶液与体积分数80%乙腈的混合液；所述C18 SPE柱为GL Science C18固相萃取柱。
...【技术特征摘要】
1.一种血浆β-淀粉样蛋白检测方法，其特征在于，所述血浆β-淀粉样蛋白检测方法检测的目标物为aβ40蛋白、aβ42蛋白；
2.根据权利要求1所述血浆β-淀粉样蛋白检测方法，其特征在于，所述肽段gaiiglmvggvv的定量子离子为968.56（b11+），所述肽段gaiiglmvggvv的定性子离子为755.45（b8+），所述肽段gaiiglmvggvvia的定量子离子为1067.63（b12+），所述肽段gaiiglmvggvvia的定性子离子为968.56（b11+）。
3.根据权利要求1所述血浆β-淀粉样蛋白检测方法，其特征在于，所述步骤（3）中胰蛋白酶的用量为：胰蛋白酶的质量与步骤（1）中树脂磁珠的质量比例为1：（200~2000），步骤（3）中酶解的时间为12~16小时，步骤（3）中用于复溶的碳酸氢氨的溶液的浓度为80~120mm，体积为50~300 μl，步骤（3）中的终止剂为甲酸。
4.根据权利要求1所述血浆β-淀粉样蛋白检测方法，其特征在于，所述步骤（1）中所述树脂磁珠为m270环氧树脂磁珠，所述待测血浆样品与m270环氧树脂磁珠的用量比例为每1ml待测血浆样品与0.8~1.2mg包被β-淀粉样蛋白n端特异性单克隆抗体的m270环氧树脂磁珠混合。
5.根据权利要求4所述血浆β-淀粉样蛋白检测方法，其特征在于，所述包被β-淀粉样蛋白n端特异性单克隆抗体的m270环氧树脂磁珠的制备方法包括以下步骤：
6.根据权利要求1所述血浆β-淀粉样蛋白检测方法，其特征在于，所述步骤（1）中，包被β-淀粉样蛋白n端特异性单克隆抗体的树脂磁珠与加入内标的待测血浆样品的比例为0...
【专利技术属性】
技术研发人员：张乔轩，黄宪章，展敏，严君，韩丽乔，张鹏伟，
申请(专利权)人：广东省中医院广州中医药大学第二附属医院，广州中医药大学第二临床医学院，广东省中医药科学院，
类型：发明
国别省市：
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