【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及石蜡切片制备领域，具体涉及一种啮齿类动物心脏石蜡切片的制备方法，以及基于制备出的石蜡切片的啮齿类动物心脏卵圆孔未闭评估方法。
技术介绍
1、卵圆孔是胎儿时期直接连通两侧心房循环的通道，正常生理条件下多于1岁内出现解剖学闭合，若大于3岁仍未闭合则称为卵圆孔未闭(patent foramen ovale，pfo)。据报道，pfo是成人最常见的先天性心脏异常，发病率在25％左右。pfo是一个潜在的通道，当右心房压力超过左心房时(例如肺动脉高压、咳嗽、打喷嚏、用力排便或大笑)，会出现右向左分流(right-to-left shunt，rls)。pfo允许微栓子、空气和炎症介质、胆碱化合物、谷氨酰胺等小分子和部分无氧静脉血避免肺循环代谢，而直接进入体循环，导致脑血管内皮细胞功能障碍或皮层兴奋性改变。
2、研究显示，在人群中具有25％发生率的卵圆孔未闭(pfo)，是卒中、偏头痛、癫痫等神经系统疾病的独立危险因素，且伴有pfo的癫痫患者多为药物难治性癫痫，具有易复发、难治愈的特点。因此，了解pfo引发神经系统疾病的机制对研发新的治疗策略，改善患者预后，提高疾病治愈率有着重大的临床意义和科学价值。
3、在目前世界各地的科学研究中，由于具有易饲养、繁殖快且繁殖率高、价格低廉、生理病理与人类相似等特点，啮齿类动物是最为常见的实验动物。此外，啮齿类动物后代存活率明显高于其他动物；而稳定繁育的转基因动物构建对探究疾病的发病机制、药物靶点挖掘和新型药物研发至关重要。综上所述，这些特点促使啮齿类动物在医学、生物学、化学
技术实现思路
1、本专利技术提供了一种啮齿类动物心脏石蜡切片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2、a)心脏组织的包埋前处理，包括：
3、s101取材：收集啮齿类动物的心脏样本，所述心脏样本包括所述啮齿类动物的完整心脏；
4、在一些实施例中，所述啮齿类动物包括小鼠或大鼠。
5、在一些实施例中，所述啮齿类动物的年龄≥1月龄。
6、s102固定：将所述心脏样本置于4％多聚甲醛中固定，所述固定时间为至少24小时；
7、s103修剪：对固定后的所述心脏样本进行修剪以去除非心脏组织，获得固定后的完整心脏；
8、在一些实施例中，所述非心脏组织包括肺组织和脂肪组织。
9、s104脱水：利用梯度乙醇对所述固定后的完整心脏进行脱水处理，获得脱水后的完整心脏；
10、在一些实施例中，所述s104步骤的具体方法包括：65％乙醇2小时，75％乙醇2小时，85％乙醇2小时，95％乙醇i 2小时，95％乙醇ii 16小时，无水乙醇i 2小时，无水乙醇ii2小时，无水乙醇iii 2小时。
11、s105透明：利用二甲苯对所述脱水后的完整心脏进行透明处理，获得透明后的完整心脏；
12、b)心脏组织的包埋和切片，包括：
13、s106包埋：将加热熔化的石蜡倒入包埋模具中后，将所述透明后的完整心脏以膈面朝上放入所述包埋模具中并调节所述透明后的完整心脏的位置，然后将所述包埋模具置于冻台上以冷却成型，获得包埋后的完整心脏；其中，所述位置的调节方式包括：将所述透明后的完整心脏的后室间沟和冠状动脉沟的交点调整至所述包埋模具的中线，从上方观察时，所述中线左侧和右侧的心脏面积大致上相同(本专利技术中，大致上相同是指从包埋模具的上方肉眼观察所述完整心脏时，无法观察到包埋模具中线左侧和右侧的心脏面积存在明显差异)；
14、本专利技术发现，完整心脏的获取和完整房间隔的暴露是本专利技术技术方案的关键之一。如果对部分心脏(例如，先将完整心脏切成毫米级的厚片后再进行切片)或在取材时心房壁等重要部分就已被伤及的心脏进行切片，则无法将房间隔区域得以完全暴露(即在后续的连续切片中无法观察到房间隔区域)，严重影响对卵圆孔未闭情况的评估。
15、本专利技术还发现，即使获取了完整心脏样本，如果对其进行随机的包埋处理(即，并非采用本专利技术的膈面朝上、将透明后的完整心脏的后室间沟和冠状动脉沟的交点调整至包埋模具的中线的方式)，也无法将房间隔区域得以完全暴露，因此无法进行后续的对卵圆孔未闭情况的评估。
16、在一些实施例中，所述s103步骤还包括对所述固定后的完整心脏的所述后室间沟和冠状动脉沟的交点做出标记，这有助于所述s106步骤中对透明后的完整心脏的位置调节。
17、s107切片：以从胸肋面至膈面的方向，对所述包埋后的完整心脏进行切片，当切过所述包埋后的完整心脏的主动脉根部且出现完整房间隔时，以3.5μm为厚度进行连续切片；
18、在一些实施例中，所述s107步骤进一步包括第一切片阶段、第二切片阶段和第三切片阶段，所述第一切片阶段包括以50–60μm为切片厚度，对所述包埋后的完整心脏进行切片，切片数包括25–40张；所述第二切片阶段包括以3.5–7μm为切片厚度进行切片，以将所述包埋后的完整心脏的房间隔区域暴露，所述第三切片阶段包括以3.5μm为切片厚度进行连续切片，连续切片总数包括5–30张。
19、本专利技术提供的啮齿类动物心脏切片的制备方法，可以通过对所述包埋后的完整心脏进行切片的方式，将对啮齿类动物心脏卵圆孔未闭是否存在这一常规技术(例如，经胸超声和经食道超声)无法检测出的三维空间的问题精确地降为二维。需要说明的是，由于本专利技术技术方案是基于离体的啮齿类动物心脏样本进行分析和评估，一旦对心脏样本进行不当的处理(如对比例所示)，这不仅无法挽回，而且会极大地浪费成本和资源，甚至影响科研项目的进程。进一步地，如果需要统计一批实验动物(特别是还有具体分组时)的心脏中是否存在卵圆孔未闭时，错误的评估(例如假阴性)还会引起影响实验结论失准等重大问题，可能影响新型药物研发和药物效果的判断，从而耽误和影响对患者的治疗。换句话说，这为本专利技术提供的方法的准确率提出了更高的要求。
20、但是，啮齿类动物心脏样本的具体形态和具体卵圆孔状态本身就存在相当大的个体差异，将其固定和包埋后，其卵圆孔状态更是难以预测。为更准确地评估啮齿类动物心脏样本中的卵圆孔未闭情况，一方面，本专利技术通过在包埋步骤中透明后的完整本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种啮齿类动物心脏石蜡切片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述原发隔和继发隔未连接包括原发隔和继发隔之间存在明显孔道和缝隙。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S107步骤进一步包括第一切片阶段、第二切片阶段和第三切片阶段，所述第一切片阶段包括以50–60μm为切片厚度，对所述包埋后的完整心脏进行切片，切片数包括25–40张；所述第二切片阶段包括以3.5–7μm为切片厚度进行切片，以将所述包埋后的完整心脏的房间隔区域暴露；所述第三切片阶段包括以3.5μm为切片厚度进行连续切片，连续切片总数包括5–30张。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述S108步骤还包括评估所述心脏样本的所述卵圆孔未闭大小的阳性等级，所述卵圆孔未闭大小的阳性等级的具体评估方法包括：
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述实际连续切片总数的计算方式包括：将所述连续切片中首次出现完整房间隔区域的切片视为所述连续切片的第一张，将所述连续切片中再次出现完整房间隔区域的切片视为所述连续切片的最后
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述啮齿类动物包括小鼠或大鼠。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述啮齿类动物的年龄≥1月龄。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述非心脏组织包括肺组织和脂肪组织。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S103步骤还包括对所述固定后的完整心脏的所述后室间沟和冠状动脉沟的交点做出标记。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S104步骤的具体方法包括：65％乙醇2小时，75％乙醇2小时，85％乙醇2小时，95％乙醇I 2小时，95％乙醇II 16小时，无水乙醇I2小时，无水乙醇II 2小时，无水乙醇III 2小时。
...【技术特征摘要】
1.一种啮齿类动物心脏石蜡切片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述原发隔和继发隔未连接包括原发隔和继发隔之间存在明显孔道和缝隙。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述s107步骤进一步包括第一切片阶段、第二切片阶段和第三切片阶段，所述第一切片阶段包括以50–60μm为切片厚度，对所述包埋后的完整心脏进行切片，切片数包括25–40张；所述第二切片阶段包括以3.5–7μm为切片厚度进行切片，以将所述包埋后的完整心脏的房间隔区域暴露；所述第三切片阶段包括以3.5μm为切片厚度进行连续切片，连续切片总数包括5–30张。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述s108步骤还包括评估所述心脏样本的所述卵圆孔未闭大小的阳性等级，所述卵圆孔未闭大小的阳性等级的具体评估方法包括：
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述实际连续切片总数的计算方式包括：将所述连续...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈蕾，李百川，高静，周向阳，
申请(专利权)人：四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：
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