【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种基于恶性肿瘤胸腹水来源的肿瘤类器官培养基及试剂盒。
技术介绍
1、正常生理状况下，人体胸腹腔的液体量并不多，其主要提供润滑和保护的作用。研究显示正常情况下胸腔液体量在200ml以内，腹腔内的液体量约50ml。如果胸腹腔出现恶性肿瘤侵润，则积液的量会显著增加。恶性胸腹腔积液可以是恶性肿瘤的首发临床表现，也可以在肿瘤进展期出现。除了脱落游离的肿瘤细胞外，恶性积液中还包括免疫细胞、间皮细胞、红细胞等细胞,以及大量的蛋白质、氨基酸、脂类、糖、电解质等，构成了独特又复杂的肿瘤微环境。由于恶性肿瘤胸腹膜转移形成的恶性胸腔积液具有特殊的肿瘤微环境，通常对化疗不敏感。临床显示，一旦肿瘤患者出现胸腹腔积液，则提示患者预后不良，生存期一般小于6个月，且严重影响患者生活质量。因此，正确鉴定和判断胸腹腔积液对辅助恶性肿瘤的诊断和治疗具有重要的临床意义。
2、目前，临床上一般通过脱落细胞学检查对胸腹腔积液进行良恶性鉴定，主要通过形态学鉴定胸腔积液中游离的肿瘤细胞从而进行诊断。但是这种脱落细胞学检查方法尚有诸多不足。一方面，部分样本中肿瘤细胞占比低，进而少量“隐匿”的肿瘤细胞可能不能被检出，造成假阴性率较高；另一方面，部分良性细胞(如间皮细胞)的形态多变，有时与恶性肿瘤细胞混合在一起难以鉴别，因此容易造成漏诊或误诊。因此，采用脱落细胞学诊断恶性胸腔积液的灵敏度较低。并且脱落细胞学检查仅是一种诊断性的检测方法，无法对恶性胸腹水中的肿瘤细胞进行功能性检测分析，这种功能性检测包括肿瘤生物学特性、肿瘤对药物敏感性的检测等
3、申请号为cn201910445410.x，名称为“一种胸腹水类器官培养基、培养方法及药敏测试方法”的专利，公开了在肿瘤患者术后的胸腔或腹腔积液中加入多种消化酶和细胞因子来制备得到一种胸腹水类器官培养基，使得胸腹水中的癌组织细胞能够在3d环境中形成类器官。然而，该专利培养基采用的成分为普通类器官培养基的通用成分，未考虑胸腹水特殊的肿瘤微环境。此外，该专利采用matrigel基质胶加胶原蛋白的支撑体系来培养细胞，细胞在该体系中的生长方式类似于“锚定”，并不符合胸腹水中肿瘤细胞生长的真实环境。申请号为cn201911367554.4，名称为“利用恶性胸腹水制备悬浮肿瘤细胞类器官的方法”的专利，公开了从恶性胸腹水中获取游离细胞和凝块部分，然后加入多种生长因子和琼脂糖凝胶等，培养12-15天获得悬浮的肿瘤细胞类器官。然而，该专利培养基采用的成分也是普通类器官培养基的通用成分，同样未考虑胸腹水特殊的肿瘤微环境。此外，该专利采用的细胞培养支撑材料是琼脂糖，但琼脂糖并不是一个天然存在的成分，其作用除了作为类器官生长的支撑材料以外并不能对类器官的生长提供其他的辅助。
4、综上所述，有必要提出新的方法和策略，以缓解现有技术中的不足。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种基于恶性肿瘤胸腹水来源的肿瘤类器官培养基及试剂盒，具体技术方案如下。
2、一种用于个体化肿瘤类器官培养的培养基，所述培养基包括恶性肿瘤患者来源的胸腹水、胸腹水微环境特征调节因子和基础培养基，其中所述胸腹水在所述培养基中的体积比为5％-20％；所述胸腹水微环境特征调节因为包括ahsg和/或mmp3。
3、优选的，所述胸腹水在所述培养基中的体积比为5％、10％、15％、20％。
4、进一步，所述基础培养基包括ad dmem/f12、hepes、glutamax、mem nonessentialamino acids、n2、penicillin、kanamycin sulfate、sodium pyruvate、humantransferrin、human insulin、heparin、bovine serum albumin、n-acetylcysteine、nicotinamide、r-spondin3、[leu15]-gastrin i human、hegf、hfgf-basic、noggin和/或a83-01中的一种或多种。
5、进一步，所述ahsg的浓度为25ng/ml至200ng/ml。
6、进一步，所述mmp3的浓度为20ng/ml至200ng/ml。
7、进一步，所述基础培养基包括hepes 1x、glutamax 1x、mem nonessential aminoacids 1x、n2 1x、0.1-05mg/ml penicillin、0.1-0.5mg/ml kanamycin sulfate、100-200mm sodium pyruvate、5-15μg/ml human transferrin、5-10μg/ml human insulin、2000-5000u/ml heparin、0.1-0.5％bovine serum albumin、1.0-1.5mm n-acetylcysteine、5-15mm nicotinamide、200-300ng/ml r-spondin3、10-20nm[leu15]-gastrin ihuman、1-10ng/ml hegf、5-15ng/ml hfgf-basic、100-200ng/ml noggin和/或300-600nm a83-01中的一种或多种。
8、进一步，所述培养基中还可以包括细胞生长基质材料，所述细胞生长基质材料为透明质酸，分子量为10kda～700kda。
9、一种半悬浮快速培养个体化肿瘤类器官的试剂盒，所述试剂盒包括上述的用于个体化肿瘤类器官培养的培养基。
10、进一步，所述试剂盒适配于动态培养系统。
11、进一步，所述动态培养系统包括水平细胞培养摇床和/或振荡培养摇床。
12、进一步，所述试剂盒中单份培养基适用的待培养细胞量为1×104个/ml至1×106个/ml。
13、优选的，上述半悬浮培养，可选的使用的容器包括24孔/12孔/48孔超低吸附板，可防止细胞贴壁生长。
14、有益技术效果
15、1)本专利技术创新性的在肿瘤类器官基础培养基中加入了患者个体化来源的胸腹水和胸腹水微环境特征调节因子ahsg和/或mmp3，可以有效促进胸腹水来源肿瘤类器官的形成和增殖。本专利技术提供的培养基使恶性胸水来源的类器官的培养成功率高达90％以上，恶性腹水来源的类器官的培养成功率为100％。
16、2)本专利技术还在肿瘤类器官培养基中加入了特定分子量的透明质酸，其作为新型的细胞生长基质材料，使肿瘤细胞在里面处于半悬浮培养状态，结合动态培养环境，可以模拟肿瘤细胞在体内所处的真实物理环境，使肿瘤类器官的培养效率显著提高。此外，透明质酸还是胸腹水里本身含有的成分，因此还可以协同促进肿瘤类器官的快速生长。
17、3)本专利技术还提供了一种半悬浮快速培养个体化肿瘤类器官的试剂盒，该试剂盒适配于动态培养，可有效模拟胸腹水在本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于个体化肿瘤类器官培养的培养基，其特征在于，所述培养基包括恶性肿瘤患者来源的胸腹水、胸腹水微环境特征调节因子和基础培养基，其中所述胸腹水在所述培养基中的体积比为5％-20％；所述胸腹水微环境特征调节因为包括AHSG和/或MMP3。
2.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述基础培养基包括AD DMEM/F12、HEPES、GlutaMAX、MEM nonessential amino acids、N2、Penicillin、kanamycin sulfate、Sodiumpyruvate、Human Transferrin、Human Insulin、Heparin、bovine serum albumin、N-acetylcysteine、Nicotinamide、R-Spondin3、[Leu15]-Gastrin I Human、hEGF、hFGF-basic、Noggin和/或A83-01中的一种或多种。
3.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述AHSG的浓度为25ng/ml至200ng/ml。
4.如权利要求1所述
5.如权利要求2所述的培养基，其特征在于，所述基础培养基包括HEPES 1x、GlutaMAX1x、MEM nonessential amino acids 1x、N2 1x、0.1-05mg/mL Penicillin、0.1-0.5mg/mLkanamycin sulfate、100-200mM Sodium pyruvate、5-15μg/ml Human Transferrin、5-10μg/ml Human Insulin、2000-5000U/ml Heparin、0.1-0.5％bovine serum albumin、1.0-1.5mM N-acetylcysteine、5-15mM Nicotinamide、200-300ng/ml R-Spondin3、10-20nM[Leu15]-Gastrin I Human、1-10ng/ml hEGF、5-15ng/ml hFGF-basic、100-200ng/mLNoggin和/或300-600nM A83-01中的一种或多种。
6.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基中还可以包括细胞生长基质材料，所述细胞生长基质材料为透明质酸，分子量为10KDa～700KDa。
7.一种半悬浮快速培养个体化肿瘤类器官的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-6任一项所述的培养基。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒适配于动态培养系统。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述动态培养系统包括水平细胞培养摇床和/或振荡培养摇床。
10.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中单份培养基适用的待培养细胞量为1×104个/ml至1×106个/ml。
...【技术特征摘要】
1.一种用于个体化肿瘤类器官培养的培养基，其特征在于，所述培养基包括恶性肿瘤患者来源的胸腹水、胸腹水微环境特征调节因子和基础培养基，其中所述胸腹水在所述培养基中的体积比为5％-20％；所述胸腹水微环境特征调节因为包括ahsg和/或mmp3。
2.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述基础培养基包括ad dmem/f12、hepes、glutamax、mem nonessential amino acids、n2、penicillin、kanamycin sulfate、sodiumpyruvate、human transferrin、human insulin、heparin、bovine serum albumin、n-acetylcysteine、nicotinamide、r-spondin3、[leu15]-gastrin i human、hegf、hfgf-basic、noggin和/或a83-01中的一种或多种。
3.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述ahsg的浓度为25ng/ml至200ng/ml。
4.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述mmp3的浓度为20ng/ml至200ng/ml。
5.如权利要求2所述的培养基，其特征在于，所述基础培养基包括hepes 1x、glutamax1x、mem nonessential amino acids 1x、n2 1x、0.1-05mg/ml penicillin、...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈崇，陆政昊，刘玉，苟马玲，刘虹余，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：
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