【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及肝素前体的生物生产领域。
技术介绍
1、肝素前体也称为n-乙酰肝素前体，是肝素和硫酸乙酰肝素的天然真核生物合成前体，存在于从水螅到脊椎动物的动物中。更具体地，它是具有重复二糖单元[→4)β-d-葡萄糖醛酸(glca)(1→4)n-乙酰-a-d-葡萄糖胺(glcnac)(l→]n.的多糖。在自然界中，大肠埃希氏菌(escherichia coli)k5和多杀巴斯德菌(pasteurella multocida)d型菌株生产肝素前体作为荚膜多糖(lindahl u.等人(1998)j.biol.chem.,273(39):24979-24982)。
2、来自肝素前体的衍生物结合至多种极其重要的多肽，包括止血因子(例如抗凝血酶iii、凝血酶)、生长因子(例如egf、vegf)和趋化因子(例如il-8、血小板因子4)以及病毒病原体(例如疱疹、登革热)的粘附蛋白。在这些衍生物中，肝素是最广泛使用的抗凝血剂或抗血栓药物之一，其可用于例如治疗性治疗血栓栓塞和弥散性血管内凝血(dic)、体外循环和预防人工透析期间血液凝固。此外，最近的研究表明，肝素可具有显著的抗肿瘤活性，与其抗凝血活性不同并有差异，而其他研究则表明肝素在治疗炎症、不孕症和传染病中发挥作用。
3、当今已知的肝素主要来源是来自动物组织(例如猪肠粘膜)的提取物，伴随着掺杂和污染的风险。
4、用于从微生物体制备肝素前体的发酵方法特别令人感兴趣，因为它们有利于通过可能的规模化、以降低的成本生产大量肝素前体。此外，与从提供非常高分子量的肝素
5、为此，重组巨大芽孢杆菌(bacillus megaterium)宿主细胞已显示出生产10至300kda范围内肝素前体的能力(a.williams等人microb.cell.fact.2009年8月12日；18(1):132)。类似地，大肠埃希氏菌k5菌株显示出生产肝素前体的能力(wang z.等人(2010)biotechnol.bioeng.,107(6):964-973)，但仍有许多问题有待解决，例如底物消耗率提高和发酵罐内氧气供应量增加。
6、与通常用于生产生物分子的其他微生物相比，酵母通常被认为是安全的。与细菌相比，它们可以快速生长并以更高的密度培养，并且不需要无菌环境。此外，酵母细胞比细菌更容易从培养基中分离，大大简化了产品提取和纯化的工艺。最后，酵母对培养基中ph变化具有更强耐受性的优势，并因此代表了更强的发酵系统。
7、然而，在酵母中，物种之间的区分特征也可能带来一定的挑战。这主要是由于物种之间新陈代谢的差异造成的。例如，巴斯德毕赤酵母(p.pastoris)中的基因组整合是稳定的，但通常会遇到来自一次转化的克隆的高度变异性，显示出各种生产力特征或生理学变化。这需要一个耗时的筛选过程，以便找到具有所想要应用的最佳特征的克隆。这种克隆变异性是巴斯德毕赤酵母作为用于生产增值化学品平台进一步发展的一个重要缺点。使用巴斯德毕赤酵母的另一个缺点是它是一种嗜甲烷菌生物体。
8、与之对比，酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)作为生产目标分子的工具是特别有用的，因为它在被人使用(例如在葡萄酒、啤酒或面包中)方面具有悠久的安全史，并且其遗传信息是本领域众所周知的完善模型。酿酒酵母还具有被普遍认为对人和动物安全的优势。更重要的是，培养这种酵母时发生的培养基酸化降低了生物发酵罐污染的可能性，并因此无需向培养基中添加抗生素。最后，许多遗传工具已被开发出来，允许对其基因组进行稳定修饰(在染色体内整合)。
9、因此，本领域仍然需要允许肝素前体高效合成和分泌的另外的肝素前体生产方法。具体地，仍然需要提供具有成本效益的生产方法并提供对人应用安全的肝素前体。
10、在特定情况下，本领域仍然需要能够获得大量特定且受控尺寸的肝素前体的肝素前体生产方法。
技术实现思路
1、本专利技术因此涉及以下各项：
2、项1：一种生产肝素前体的重组酵母细胞，其中所述重组细胞包含：
3、(a)编码具有肝素前体合酶(hss)活性的多肽的一种或多种重组核酸；和
4、(b)编码具有udp-葡萄糖脱氢酶(udp-glcdh或hasb)活性的多肽的一种或多种重组核酸。
5、如实例中所示，本专利技术的重组酵母允许在不能天然生产肝素前体的酵母细胞中生产肝素前体。
6、所述有利特性可以通过将酵母与下文所述的额外修饰重组结合来进一步增强。
7、项2：根据项1所述的重组细胞，其中所述重组细胞包含编码具有葡萄糖醛酰基-二磺基葡萄糖胺葡萄糖醛酸酶活性的多肽的核酸，其中所述具有葡萄糖醛酰基-二磺基葡萄糖胺葡萄糖醛酸酶活性的多肽包含分泌信号和任选的锚定信号。
8、项3：一种生产肝素前体的重组宿主细胞，其中所述重组细胞包含：
9、(a)编码具有肝素前体合酶(hss)活性的多肽的一种或多种重组核酸；
10、(b)编码具有udp-葡萄糖脱氢酶(udp-glcdh或hasb)活性的多肽的一种或多种重组核酸；和
11、(c)编码具有葡萄糖醛酰基-二磺基葡萄糖胺葡萄糖醛酸酶活性的多肽的一种或多种重组核酸，
12、其中具有葡萄糖醛酰基-二磺基葡萄糖胺葡萄糖醛酸酶活性的多肽包含分泌信号和任选的锚定信号，使得肝素前体、特别是所想要分子量的肝素前体由宿主细胞生产。
13、项4：根据项2或3所述的重组细胞，其中编码具有葡萄糖醛酰基-二磺基葡萄糖胺葡萄糖醛酸酶活性的多肽的核酸获自或源自解肝磷脂土地杆菌(pedobacter heparinus)。
14、项5：根据项2至4中任一项所述的重组细胞，其中编码具有葡萄糖醛酰基-二磺基葡萄糖胺葡萄糖醛酸酶活性的多肽的核酸在选自由以下组成的组的启动子的控制下：ptef1、pccw12、pccw12.sba、pccw12.sar、ppdc1、ptef3、ptdh3、pnup57和pccw10.ago。
15、项6：根据项2至5中任一项所述的重组细胞，其中所述肝素前体的分子量在小于50kda的范围内，优选在约20kda至约50kda的范围内。
16、项7：根据项2至5中任一项所述的重组细胞，其中所述肝素前体的分子量在大于50kda的范围内，优选在约50kda至约250kd的范围内。
17、项8：根据项2至5中任一项所述的重组细胞，其中所述肝素前体的分子量在大于100kda的范围内，优选在约100kda至约1500kda的范围内。
18、项9：根据项1至8中任一项所述的重组细胞，其中编码具有udp-葡萄糖脱氢酶(udp-glcdh或hasb)活性的多肽的核酸获自或源自以下中的至少一者：拟南芥(arabido本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种生产肝素前体的重组酵母细胞，其中，所述重组细胞包含：
2.根据权利要求1所述的重组细胞，其中，所述重组细胞包含编码具有葡萄糖醛酰基-二磺基葡萄糖胺葡萄糖醛酸酶活性的多肽的核酸，其中，所述具有葡萄糖醛酰基-二磺基葡萄糖胺葡萄糖醛酸酶活性的多肽包含分泌信号和任选的锚定信号。
3.一种生产肝素前体的重组宿主细胞，其中，所述重组细胞包含：
4.根据权利要求2或3所述的重组细胞，其中，编码具有葡萄糖醛酰基-二磺基葡萄糖胺葡萄糖醛酸酶活性的多肽的核酸获自或源自解肝磷脂土地杆菌。
5.根据权利要求2至4中任一项所述的重组细胞，其中，编码具有葡萄糖醛酰基-二磺基葡萄糖胺葡萄糖醛酸酶活性的多肽的核酸在选自由以下组成的组的启动子的控制下：pTEF1、pCCW12、pCCW12.sba、pCCW12.Sar、pPDC1、pTEF3、pTDH3、pNUP57和pCCW10.ago。
6.根据权利要求2至5中任一项所述的重组细胞，其中，所述肝素前体的分子量在小于50kDa的范围内，优选在约20kDa至约50kDa的范围内。
7
8.根据权利要求2至5中任一项所述的重组细胞，其中，所述肝素前体的分子量在大于100kDa的范围内，优选在约100kDa至约1500kDa的范围内。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的重组细胞，其中，编码具有UDP-葡萄糖脱氢酶(UDP-GlcDH或HASB)活性的多肽的核酸获自并且源自以下中的至少一者：拟南芥、小球藻属病毒PBCV1或兽瘟链球菌，并且特别是来自拟南芥或小球藻属病毒PBCV1。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的重组细胞，其中，编码具有肝素前体合酶(HSS)活性的多肽的核酸获自或源自多杀巴斯德菌。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的重组细胞，其中，所述重组细胞还包含至少一种编码以下中的一者或多者的重组核酸：
12.根据权利要求1至11中任一项所述的重组细胞，其中，所述重组细胞还包含至少一种编码以下中的一者或多者的重组核酸：
13.根据权利要求11或12所述的重组细胞，其中：
14.根据权利要求3至13中任一项所述的重组宿主细胞，其中，所述重组宿主细胞是酵母。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的重组宿主细胞，其中，所述重组细胞属于酵母属，或属于念珠菌属，或属于克鲁维酵母菌属，或属于汉逊酵母属，或属于耶氏酵母属，或属于德巴利酵母属，或属于阿舒囊霉属，并且特别是属于酵母属。
16.根据权利要求15所述的重组细胞，其中，所述重组细胞选自由以下组成的组：酿酒酵母、布拉氏酵母、贝酵母、奇异酵母、米卡酵母、卡氏酵母、白念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母、多孢克鲁维酵母、耐热克鲁维酵母、多形汉逊酵母、解脂耶氏酵母、汉逊德巴利酵母和棉阿舒囊霉，并且优选酿酒酵母。
17.一种生产肝素前体的方法，其包括：
18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述肝素前体的分子量为约20kDa至约50kDa。
19.根据权利要求17所述的方法，其中，所述肝素前体的分子量为约50kDa至约150kDa。
20.根据权利要求17所述的方法，其中，所述肝素前体的分子量为约150kDa至约1500kDa。
21.根据权利要求17至20中任一项所述的方法，其中，所述重组细胞是属于酵母属的酵母，并且特别是酿酒酵母。
22.根据权利要求17至21中任一项所述的方法，其中，所述足以生产肝素前体的时间是约35至约50小时、优选约40至约50小时、优选约48小时的时间段。
23.根据权利要求17至22中任一项所述的方法，其中，所生产的肝素前体的分子量由步骤(a)期间调节所述培养基的pH来控制。
24.根据权利要求17至23中任一项所述的方法，其中，所述方法以工业规模进行，优选地其中所述培养基是至少约100L，更优选地在约1000L至约3000L的范围内，甚至更优选约10,000L或甚至更优选约100,000L，或甚至约250,000L。
25.一种肝素前体，其是从根据权利要求1至16中任一项所述的重组细胞可获得的或从根据权利要求17至24中任一项所述的方法可获得的。
26.一种培养基，其包含根据权利要求25所述的肝素前体。
27.一种组合物，其包含根据权利要求25所...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种生产肝素前体的重组酵母细胞，其中，所述重组细胞包含：
2.根据权利要求1所述的重组细胞，其中，所述重组细胞包含编码具有葡萄糖醛酰基-二磺基葡萄糖胺葡萄糖醛酸酶活性的多肽的核酸，其中，所述具有葡萄糖醛酰基-二磺基葡萄糖胺葡萄糖醛酸酶活性的多肽包含分泌信号和任选的锚定信号。
3.一种生产肝素前体的重组宿主细胞，其中，所述重组细胞包含：
4.根据权利要求2或3所述的重组细胞，其中，编码具有葡萄糖醛酰基-二磺基葡萄糖胺葡萄糖醛酸酶活性的多肽的核酸获自或源自解肝磷脂土地杆菌。
5.根据权利要求2至4中任一项所述的重组细胞，其中，编码具有葡萄糖醛酰基-二磺基葡萄糖胺葡萄糖醛酸酶活性的多肽的核酸在选自由以下组成的组的启动子的控制下：ptef1、pccw12、pccw12.sba、pccw12.sar、ppdc1、ptef3、ptdh3、pnup57和pccw10.ago。
6.根据权利要求2至5中任一项所述的重组细胞，其中，所述肝素前体的分子量在小于50kda的范围内，优选在约20kda至约50kda的范围内。
7.根据权利要求2至5中任一项所述的重组细胞，其中，所述肝素前体的分子量在大于50kda的范围内，优选在约50kda至约250kd的范围内。
8.根据权利要求2至5中任一项所述的重组细胞，其中，所述肝素前体的分子量在大于100kda的范围内，优选在约100kda至约1500kda的范围内。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的重组细胞，其中，编码具有udp-葡萄糖脱氢酶(udp-glcdh或hasb)活性的多肽的核酸获自并且源自以下中的至少一者：拟南芥、小球藻属病毒pbcv1或兽瘟链球菌，并且特别是来自拟南芥或小球藻属病毒pbcv1。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的重组细胞，其中，编码具有肝素前体合酶(hss)活性的多肽的核酸获自或源自多杀巴斯德菌。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的重组细胞，其中，所述重组细胞还包含至少一种编码以下中的一者或多者的重组核酸：
12.根据权利要求1至11中任一项所述的重组细胞，其中，所述重组细胞还包含至少一种编码以下中的一者或多者的重组核酸：
13.根据权利要求11或12所述的重组细胞，其中：
14.根据权利要求3至13中任一项所述的重组宿主细胞，其中，所述重组宿主细胞是酵母。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的重组宿主细胞，其中，所述重组细胞属于酵母属，或属于念珠菌属，或属于克鲁维酵母菌属，或属于汉逊酵母属，或属于耶氏酵母属，或属于德巴利酵母属，或属...
【专利技术属性】
技术研发人员：多米尼克·路易斯，卡琳·杰尔拉尔登，缪里·梅尔卡姆，多米尼克·托马斯，
申请(专利权)人：奇华顿股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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