【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物分子标记，具体涉及一种用于检测梨需冷量性状的遗传分子标记及其应用。
技术介绍
1、梨是一种落叶果树作物，起源于我国西南横断山脉附近的高海拔地区，经过长期的自然选择与人为驯化，目前已成为我国栽培范围最广的温带果树作物，在全国各地形成了适应当地栽培气候环境的一系列地方品种。
2、梨在长期进化过程中，形成了芽自然休眠这一应对冬季寒冷气候变化的生物学过程。当梨芽进入自然休眠后，即使处于适合生长的环境下也不能恢复生长，必须经过较长时间的低温暴露后才能自然解除休眠，而解除休眠所需的低温时长(需冷量)在不同品种间变异很大。不同品种的需冷量与其环境适应性关系密切，起源于华南地区的品种一般表现为低需冷量的性状。
3、近年来，随着全球气候变化的不断加剧，我国很多地区冬季低温时长变短，原本适栽的品种出现冬季休眠解除不足的现象。因此，起源于我国南方的地方品种作为低需冷量性状的重要来源受到重视。但是，如何利用分子标记区分南方地区低需冷量品种尚未见报道。
4、dam(dormancy associated mads-box)蛋白是调控木本植物休眠的关键转录因子，属于mads-box家族的agl24/svp分支。在梨中已经克隆到5个dam基因，分别位于8号和15号染色体上，且在8号染色体上呈串联重复分布；在‘砀山酥梨’芽的内休眠过程中，5个dam基因表达量均有所变化，其表达水平随休眠程度的加深不断上升，在休眠解除后迅速下降(gao et al,2021)。但是dam基因的变异与品种的地理分布之间的关系尚未
5、随着植物科学领域的不断发展，植物品种鉴定进入到基因水平。相较于第一代rflp和第二代bsa，单核苷酸多态性(snp)作为第三代分子标记技术具有高通量、低成本、易操作等众多优点，是未来分子标记的主阵地、极具前景。竞争性等位基因特异性pcr(competitive allele specific pcr，kasp)是一种基于snp的新型基因分型技术，可在广泛的基因组dna样品中(甚至是一些复杂基因组的dna样品)，对snps和特定位点上的indels进行精准的双等位基因判断。由于梨是严格的自交品种，大部分品种是由芽变选种人工繁殖而来，各品种间基因组极为相似，遗传背景单一。目前有关梨性状鉴定的分子标记比较少见。因此，开发梨的kasp分子标记，对品种鉴别以及新品种选育具有重要意义。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种用于鉴定梨需冷量性状的遗传分子标记，利用该分子标记可以低成本区分出低需冷量梨品种，以适应在冬季低温时长较短的地区种植。
2、为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
3、本专利技术提供了单核苷酸多态性(snp)位点作为检测靶点在制备检测梨需冷量性状的试剂盒中的应用，所述单核苷酸多态性位点为seq id no.1所示的核苷酸序列的第216位存在c＞a的多态性。
4、本专利技术通过基因组重测序比较了需冷量普遍较低的梨品种以及高需冷量品种的dam基因座序列，发现在低需冷量梨品种的dam1基因(ncbi登录号xm_009377956.3)的cds区(核苷酸序列如seq id no.1所示)的第216位存在一个碱基替换的snp位点，所述位置的核苷酸突变类型为c→a，该突变位点位于‘鸭梨’基因组8号染色体第18682690位。
5、通过分析大样本量梨的上述位点的基因型，dam1基因的cds区第216位的碱基包括碱基c和碱基a两种状态，相应基因型为cc和ca。
6、研究表明，上述c>a的碱基变异与低需冷量性状存在显著相关。当该碱基为c时是正常的dam1基因遗传状态，当该碱基是a时形成了终止密码子taa，导致蛋白翻译的提前终止，使所形成的蛋白缺少了后续的活性结构域，导致蛋白功能失活，植株呈现低需冷量性状。相较于基因型cc的个体春季初花时间，带有ca基因型的个体春季初花时间显著提前，对应低需冷量性状。
7、因此，上述snp可以作为鉴定低需冷量性状梨品种的分子标记，或者利用低需冷量性状梨品种作为亲本进行品种育种时对后代进行需冷量判定的遗传分子标记。
8、作为上述分子标记的应用，本专利技术提供了一种检测梨需冷量性状的试剂盒，所述试剂盒包括：用于检测seq id no.1所示的核苷酸序列中第216位的单核苷酸多态性的特异性引物。
9、所述特异性引物为两对，针对上述dam基因特定位点的单核苷酸多态性，本专利技术设计了两条特异性上游引物和一条特异性的下游引物，每一条特异性上游引物分别对应相应的c、a碱基序列，分别与下游引物做pcr特异性扩增，根据相应配对引物扩增的pcr阳性条带判断对应碱基的基因型是纯合子还是杂合子。
10、进一步的，引物对ⅰ的上下游引物序列分别为：
11、上游引物：5'-taccaaggatgtgattgcaaggtac-3'(seq id no.2)；
12、下游引物：5'-atttgatccgatttttccccaccagtatg-3'(seq id no.4)；
13、引物对ⅱ的上下游引物序列分别为：
14、上游引物：5'-taccaaggatgtgattgcaaggtaa-3'(seq id no.3)；
15、下游引物：5'-atttgatccgatttttccccaccagtatg-3'(seq id no.4)。
16、本专利技术还提供了一种检测梨需冷量性状的kasp试剂盒，所述kasp试剂盒包括：用于特异性检测seq id no.1所示的核苷酸序列中第216位的单核苷酸多态性的引物组。
17、具体的，所述引物组包括两条带有不同通用荧光接头序列的上游分型引物和一条下游通用引物。kasp反应体系中含有两条荧光探针和两条与之互补的淬灭探针，且荧光探针与上游分型引物的通用荧光接头序列一致。随着pcr扩增，通用荧光接头序列引入与snp对应的pcr产物中，荧光探针通过与通用荧光接头序列互补的dna链结合而添加到pcr产物中，不再与其互补的淬灭探针结合，从而产生荧光信号，反应结束后通过读取反应液中的两种不同波长的荧光强度，进而判断对应碱基的基因型。
18、进一步的，kasp反应引物组序列为：
19、上游分型引物f1：5'-gaaggtgaccaagttcatgcttaccaaggatgtgattgcaaggtac-3'(seq id no.5)；
20、上游分型引物f2：5'-gaaggtcggagtcaacggatttaccaaggatgtgattgcaaggtaa-3'(seq id no.6)；
21、下游通用引物r：5'-atttgatccgatttttccccaccagtatg-3'(seq id no.4)。
22、进一步的，所述试剂盒还包括ksap反应所需的pcr premix等试剂，可采用市售常规kasp标记试本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.单核苷酸多态性位点作为检测靶点在制备检测梨需冷量性状的试剂盒中的应用，其特征在于，所述单核苷酸多态性位点为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第216位存在C＞A的多态性。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括：用于检测SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列中第216位的单核苷酸多态性的特异性引物。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述特异性引物为两对，其中引物对Ⅰ的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；引物对Ⅱ的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
4.一种检测梨需冷量性状的KASP试剂盒，其特征在于，所述KASP试剂盒包括：用于特异性检测SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列中第216位的单核苷酸多态性的引物组。
5.如权利要求4所述的检测梨需冷量性状的KASP试剂盒，其特征在于，所述引物组包括上游分型引物F1、上游分型引物F2和下游通用引物R，其核苷酸序列分别如SEQ
6.一种鉴定低需冷量梨品种/株系的方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.如权利要求6所述的鉴定低需冷量梨品种/株系的方法，其特征在于，步骤(1)中，采用核苷酸序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.4所示的引物组进行KASP反应检测；步骤(2)中，对反应产物进行荧光数据读取，根据不同波长荧光的相对强度对每个样品进行基因分型：
8.如权利要求7所述的鉴定低需冷量梨品种/株系的方法，其特征在于，KASP反应体系的组成包括：以总体积10μL计，含1×KASP预混液，上游分型引物F1的终浓度为0.1μM，上游分型引物F2的终浓度为0.1μM，下游通用引物R的终浓度为0.2μM，基因组DNA模版10～50ng。
9.如权利要求7所述的鉴定低需冷量梨品种/株系的方法，其特征在于，KASP反应条件为：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性15s，61～55℃退火并延伸60s，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.6℃；95℃变性15s，55℃退火并延伸60s，28～35个循环。
...【技术特征摘要】
1.单核苷酸多态性位点作为检测靶点在制备检测梨需冷量性状的试剂盒中的应用，其特征在于，所述单核苷酸多态性位点为seq id no.1所示的核苷酸序列的第216位存在c＞a的多态性。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括：用于检测seq id no.1所示的核苷酸序列中第216位的单核苷酸多态性的特异性引物。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述特异性引物为两对，其中引物对ⅰ的上游引物的核苷酸序列如seq id no.2所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.4所示；引物对ⅱ的上游引物的核苷酸序列如seq id no.3所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.4所示。
4.一种检测梨需冷量性状的kasp试剂盒，其特征在于，所述kasp试剂盒包括：用于特异性检测seq id no.1所示的核苷酸序列中第216位的单核苷酸多态性的引物组。
5.如权利要求4所述的检测梨需冷量性状的kasp试剂盒，其特征在于，所述引物组包括上游分型引物f1、上游分型引物f2和下游通用引物r，其核苷酸序列分别如seq id no.5、seq ...
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。