秀丽隐杆线虫膜蛋白复合体的纯化方法,本发明专利技术属于膜蛋白分离纯化技术领域，本发明专利技术的提供的一种分离出秀丽隐杆线虫中的膜蛋白复合体的方法，将秀丽隐杆线虫进行均质化处理来制备膜，后通过去垢剂溶解膜萃取膜蛋白，再用beads亲和的方法纯化膜蛋白，为了保证蛋白活性，用竞争性洗脱或是蛋白酶切的方法获得膜蛋白。采用上述方法纯化出的秀丽隐杆线虫体内的膜蛋白，有利于解析膜蛋白的结构与功能。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于膜蛋白分离纯化，具体涉及一种秀丽隐杆线虫表达的膜蛋白复合体的分离纯化方法。
技术介绍
1、膜蛋白在细胞中扮演着重要的角色，它们通常存在于细胞或者某些特定的细胞器膜上，参与细胞与细胞之间、细胞与细胞基质之间的相互联系及细胞的形成过程，各种离子、代谢产物和蛋白质的跨膜运输。由于膜蛋白的一些特性，使它和普通蛋白相比纯化更具有难度。
2、目前研究膜蛋白质的技术是先把它们分散在水溶液的环境中，参照水溶性蛋白质的方法进行操作，为了有效的研究膜蛋白质，将其溶解于水环境是必要的前提，目前通常是通过加入去污剂使得膜蛋白质和脂类在水中形成可溶性的复合物来完成的。膜蛋白质的溶解是一个粗暴的处理过程，在此过程中经常会发生蛋白质变性或聚集，为了避免蛋白质的损失和失活，该过程优化时需要非常小心。
3、除此之外，膜蛋白的内源表达通常来说是比较低的，如果要提高产量可以通过重组膜蛋白的过表达，通常选择大肠杆菌，酵母，哺乳动物细胞或者昆虫细胞表达体系。然而，外源表达的翻译后修饰例如糖基化、磷酸化、乙酰化和天然蛋白的不同可能会导致重组蛋白的某些活性下降。原核表达虽系统成本低，周期短，但原核表达缺乏真核蛋白表达和折叠的分子伴侣及翻译后修饰系统；酵母表达虽具备必要的分子伴侣和修饰系统，但纯化产物稳定性差，纯化流程相对繁琐；哺乳动物细胞或者昆虫细胞表达体系，纯化周期较长且成本高昂。迄今为止大量的膜蛋白质，尤其是细菌来源的膜蛋白质，已经被成功的过表达、分离纯化并在分子水平上加以鉴定，但活体真核动物来源的膜蛋白纯化仍面临巨大挑战。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种分离出秀丽隐杆线虫中的膜蛋白复合体的方法，将秀丽隐杆线虫进行均质化处理来制备膜，后通过去垢剂溶解膜萃取膜蛋白，再用beads亲和的方法纯化膜蛋白，为了保证蛋白活性，用竞争性洗脱或是蛋白酶切的方法获得膜蛋白。
2、秀丽隐杆线虫膜蛋白复合体的纯化方法包括如下步骤：
3、1、缓冲液的制备
4、洗涤缓冲液：0.8～1.2mm mgso4，40～45mm na2hpo4，80～120mm nacl，20～25mmkh2po4；
5、裂解缓冲液：10～20mm左旋咪唑，0.05％～0.2％ ddm，100～200mm nacl，5～15mmtris-hcl，5～15mm edta，ph值为7.0～8.0；
6、beads平衡缓冲液：100～200mm nacl，5～15mm tris-hcl，5～15mm edta，ph值为7.0～8.0；
7、beads洗杂缓冲液：100～200mm nacl，5～15mm tris-hcl，5～15mm edta，0.01％～0.1％ np-40，ph值为7.0～8.0；
8、2、秀丽隐杆线虫的收集与破碎
9、(1)线虫的收集与保存：用液体大规模培养秀丽隐杆线虫后，收集尽可能多的、活跃的成年虫子，用洗涤缓冲液洗涤，用液氮速冻后，放置在-80℃保存，裂解时取出融化，每次纯化所用的虫体的量，是根据膜蛋白在秀丽隐杆线虫体内的表达量来确定的。
10、(2)线虫的破碎：将冻融后的线虫置于冰上，用冰的裂解缓冲液润洗高压均质机，再向裂解缓冲液中加入2～3片蛋白酶混合抑制剂，将线虫用裂解缓冲液冲洗进高压均质机，在2～8℃的低温环境下下进行线虫虫体的破碎，高压均质机压力升至800～1200kpa，线虫在高压均质机中过2～3次，取样显微镜下观察，确保线虫虫体破碎充分。
11、3、溶膜
12、(3)溶膜：溶膜是整个膜蛋白纯化制备过程中最关键的步骤，用去污剂将膜蛋白从它们所在的膜脂中提取至水溶液环境；所述的去污剂为ddm(十二烷基-β-d-麦芽糖苷)，用1％～3％浓度的ddm萃取上一步中获得的虫体碎片3～5h。
13、提取是用终浓度为2％的ddm于2～8℃对破碎充分分散均匀的虫体进行溶膜萃取3～5h。
14、(4)离心：经过数小时的溶膜处理，所需的膜蛋白被萃取到了水溶液中，为了给beads提供较为清澈的溶液环境，需给萃取后的溶液进行离心，4℃，18000～19500rpm离心20～30min，弃去沉淀及漂浮的白色脂质层，获得上清液。
15、4、纯化
16、(5)标签蛋白与特异性beads结合：将平衡好的beads加入到上清液中，于2～8℃垂直混合仪上结合过夜；优选4℃。
17、(6)离心与洗杂：将过夜结合的溶液体系4℃离心3～5分钟(若所用beads为磁珠，则在磁力架上吸附)，弃去上清液，获得已与目标蛋白结合的beads，用beads洗杂缓冲液洗涤3～5次，其目的是为了除去beads上结合的非特异性结合杂蛋白。
18、(7)洗脱：为了获得高活性的膜蛋白复合体，可采用竞争肽竞争性洗脱的方法洗脱膜蛋白复合体，若是含有蛋白酶切割位点位于标签和目的蛋白之间，还可用蛋白酶切割的方法使目的蛋白与beads分离。通过离心，将获得富含目的蛋白的洗脱液。
19、5、鉴定
20、(8)跑胶验证：进一步地，将所获得的纯化样品进行凝胶电泳，根据条带大小来判断所得产物是否为目的蛋白。
21、(9)质谱验证：为了获得更可靠的验证结果，可将跑胶的目的条带进行切割后，进行蛋白质谱检测。
22、采用上述方法纯化出的秀丽隐杆线虫体内的膜蛋白，有利于解析膜蛋白的结构与功能。
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【技术保护点】
1.一种秀丽隐杆线虫膜蛋白复合体的纯化方法，其特征在于，所述的纯化方法包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的秀丽隐杆线虫膜蛋白复合体的纯化方法，其特征在于，Beads平衡缓冲液采用的是：100～200mM NaCl，5～15mM Tris-Hcl，5～15mM EDTA，PH值为7.0～8.0；或，
3.如权利要求1所述的秀丽隐杆线虫膜蛋白复合体的纯化方法，其特征在于，在溶膜处理前对虫体做如下处理：
4.如权利要求3所述的秀丽隐杆线虫膜蛋白复合体的纯化方法，其特征在于，所述的洗涤缓冲液：0.8～1.2mM MgSO4，40～45mM Na2HPO4，80～120mM NaCl，20～25mM KH2PO4；
【技术特征摘要】
1.一种秀丽隐杆线虫膜蛋白复合体的纯化方法，其特征在于，所述的纯化方法包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的秀丽隐杆线虫膜蛋白复合体的纯化方法，其特征在于，beads平衡缓冲液采用的是：100～200mm nacl，5～15mm tris-hcl，5～15mm edta，ph值为7.0～8.0；或，
...
【专利技术属性】
技术研发人员：龚芳，刘慧，
申请(专利权)人：深圳市杰安能生物医学仪器有限公司，
类型：发明
国别省市：
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