【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种高滴度baev假型慢病毒载体及其制备方法。
技术介绍
1、慢病毒载体是一种源于人类免疫缺陷病毒的基因载体，被广泛用于真核细胞如造血干细胞和神经细胞的基因编辑。随着对基因递送工具长期深入的研究，慢病毒作为基因载体已然广泛用于基础研究和临床实践当中。随着后基因组时代的来临，基因治疗在医学研究中所占比重越来越大。一些难以根治或者缓解的传统疾病可以通过基因治疗缓解甚至治愈，慢病毒为未来基因治疗的发展提供了新的工具和方法。其中水疱性口炎病毒g蛋白(vsv-g)假型慢病毒已被广泛应用于基因治疗。但该假型慢病毒转导造血干细胞及部分淋巴细胞时，转导效率相对较低。
2、申请号为201280053749.1的专利申请公开了一种生产用突变体狒狒内源性逆转录病毒(baev)糖蛋白假型化的慢病毒载体的方法，具体为：在转染前24小时，将2.6×106个hek293t细胞接种至10-cm2组织培养皿上。使293t细胞在补充有10％胎牛血清(fcs，gibco)的dulbecco改良的eagle培养基(dmem，invitrogen)中生长。使用8.6μg gag-pol包装构建体8.91和编码gfp的hiv-1衍生的sin转移载体phiv-sffv-gfp-sin和2.5μg编码vsv-g糖蛋白(gp)的pmd.g或7μgphcmv-rd114/tr、phcmv-baevwt、phcmv-baev/tr或phcmv-baevrless通过磷酸钙沉淀转染细胞。在转染后16小时，用无血清培养基(opti-mem，inv
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种制备高滴度baev假型慢病毒载体的方法，以及由该方法制备得到的baev假型慢病毒载体。
2、本专利技术提供了一种制备假型慢病毒载体的方法，所述方法包括以下步骤：
3、(a)将包装细胞接种于培养容器中培养；
4、(b)将穿梭质粒、包装质粒和包膜质粒加入细胞培养基中，混合得到a液；将转染试剂加入细胞培养基中，混合得到b液；
5、所述穿梭质粒、包装质粒和包膜质粒的质量比为1：(0.5-1.5)：(0.85-2.00)；
6、(c)待步骤(1)包装细胞汇合度为70％-90％时，将a液与b液混合并加入培养容器进行转染；
7、(d)转染结束后，收获假型慢病毒载体。
8、进一步地，步骤(b)中，所述穿梭质粒、包装质粒和包膜质粒的质量比为1：1：(0.97-1.34)；转染试剂与三种质粒总质量的比值为(2-4)：1；所述转染试剂为聚乙烯亚胺，lipofectaminetm2000或者lipofectaminetm3000。
9、进一步地，步骤(b)中，所述穿梭质粒、包装质粒和包膜质粒的质量比为1：1：0.98；转染试剂与三种质粒总质量的比值为3：1。
10、进一步地，步骤(b)中，所述包膜质粒含有编码baev糖蛋白或修饰的baev糖蛋白的序列，优选地，所述修饰的baev糖蛋白为baev-rless糖蛋白。
11、进一步地，步骤(b)中，所述穿梭质粒为pcdh-gfp，包装质粒为pspax2，包膜质粒为pcmv-baev-rless。
12、进一步地，步骤(a)中所述包装细胞为胚胎肾细胞；
13、步骤(b)中所述培养基为减血清培养基；转染前1小时，培养容器中的培养基为opti-mem培养基；转染6小时后，培养容器中的培养基为10％胎牛血清培养基。
14、进一步地，步骤(c)中，所述转染的时间为48小时以上。
15、进一步地，步骤(a)中，在将包装细胞接种于培养容器中培养之前，还包括以下步骤：用多聚-l-赖氨酸溶液包被培养容器。
16、进一步地，所述多聚-l-赖氨酸溶液的浓度为6-12μg/ml，优选为10μg/ml。
17、本专利技术还提供了上述方法制备得到的假型慢病毒载体。
18、本专利技术中，baev假型慢病毒载体指用突变体baev糖蛋白假型化的慢病毒载体，该载体的病毒包膜具有baev包膜的特有结构和表面标志物。
19、baev-rless糖蛋白是一种修饰的baev包膜糖蛋白，指胞质尾结构域缺乏融合抑制性r肽的baev包膜糖蛋白。
20、融合抑制性r肽指包膜糖蛋白的胞质尾结构域的c-末端部分，其携带酪氨酸内吞信号-yxxl，并在病毒颗粒成熟过程中被病毒蛋白酶裂解，从而增强包膜糖蛋白的膜融合。baev包膜糖蛋白的融合抑制性r肽通常位于野生型baev包膜糖蛋白的氨基酸547和564之间。
21、与现有技术相比，本专利技术制备baev假型慢病毒载体的方法取得了以下有益效果：
22、(1)本专利技术通过调整包装baev假型慢病毒的穿梭质粒、包装质粒和包膜质粒的比例，明显提高了病毒的包装效率，提高了病毒滴度。
23、(2)本专利技术通过在转染hek293t细胞之前使用多聚-l-赖氨酸包被培养皿，使hek293t细胞在培养皿底的贴壁更加紧密，减少了在生产病毒过程中因合胞体出现而导致的细胞脱落凋亡，达到了提高病毒滴度目的。
24、(3)本专利技术将使用多聚-l-赖氨酸包被培养皿与调整转染体系中质粒比例结合，进一步显著提高了慢病毒滴度，降低了baev假型慢病毒载体的生产成本。
25、显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
26、以下通过实施例形式的具体实施方式，对本专利技术的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。
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1.一种制备假型慢病毒载体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(b)中，所述穿梭质粒、包装质粒和包膜质粒的质量比为1：1：(0.97-1.34)；转染试剂与三种质粒总质量的比值为(2-4)：1；所述转染试剂为聚乙烯亚胺，LipofectamineTM2000或者LipofectamineTM3000。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(b)中，所述穿梭质粒、包装质粒和包膜质粒的质量比为1：1：0.98；转染试剂与三种质粒总质量的比值为3：1。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(b)中，所述包膜质粒含有编码BaEV糖蛋白或修饰的BaEV糖蛋白的序列，优选地，所述修饰的BaEV糖蛋白为BaEV-Rless糖蛋白。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(b)中，所述穿梭质粒为pCDH-GFP，包装质粒为pSpax2，包膜质粒为pCMV-BaEV-Rless。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)中所述包装细胞为胚胎肾细胞
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(c)中，所述转染的时间为48小时以上。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，步骤(a)中，在将包装细胞接种于培养容器中培养之前，还包括以下步骤：用多聚-L-赖氨酸溶液包被培养容器。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述多聚-L-赖氨酸溶液的浓度为6-12μg/mL，优选为10μg/mL。
10.权利要求1-9任一项所述方法制备得到的假型慢病毒载体。
...【技术特征摘要】
1.一种制备假型慢病毒载体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(b)中，所述穿梭质粒、包装质粒和包膜质粒的质量比为1：1：(0.97-1.34)；转染试剂与三种质粒总质量的比值为(2-4)：1；所述转染试剂为聚乙烯亚胺，lipofectaminetm2000或者lipofectaminetm3000。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(b)中，所述穿梭质粒、包装质粒和包膜质粒的质量比为1：1：0.98；转染试剂与三种质粒总质量的比值为3：1。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(b)中，所述包膜质粒含有编码baev糖蛋白或修饰的baev糖蛋白的序列，优选地，所述修饰的baev糖蛋白为baev-rless糖蛋白。<...
【专利技术属性】
技术研发人员：曾金杰，余鼎，梁洪，刘东，赵义林，吴佳君，
申请(专利权)人：成都蓉生药业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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