生物反应器组织工程活性人工皮肤产业化生产含有活化素Ａ的无血清培养液及其配制方法技术

本发明专利技术属于生物医学领域，涉及生物反应器、细胞组织工程、活性人工皮肤大规模生产的培养液。本发明专利技术提供了一种用于大规模组织工程生产活性人工皮肤的培养液及其具体配制方法，该培养液含有如下组分：细胞生长因子３－３０ｎｇ／ｍＬ、胰岛素２－３０μｇ／ｍＬ、氢化可的松０．２－０．６μｇ／ｍＬ、垂体提取物３－３０μｇ／ｍＬ、钙离子０．５－５．５ｍｍｏｌ／Ｌ、转铁蛋白３－３０μｇ／ｍＬ、青霉素２０－６０Ｕ／ｍＬ、链霉素２０－６０ｍｇ／ｍＬ、活化素Ａ?０．１－０．９ｎｇ／ｍＬ。本方法提供的培养液适合于大规模配制，性能稳定，保质期长，便于产品的大规模合成及规模化生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物医学组织工程领域，特别是涉及生物反应器、细胞组织工程、活性人工皮肤大规模产业化生产含有活化素A的无血清培养液。
技术介绍
皮肤是人体最大的组织器官，也是人体最重要的器官之一，它主要有三部分组成， 即最外面的表皮层，中间的真皮层和最下面的皮下组织构成。表皮层和真皮层之间含有基 底膜，皮肤组织工程经历了从表皮替代物、真皮替代物到具有双层结构的复合组织工程皮 肤的阶段，有关基础研究及应用研究有了很大的进展，但如何能够大规模地产业化地体外 生产组织工程皮肤，一直是一个挑战，难题至今没能解决。阻碍了组织工程皮肤的临床应用 及产业化。目前，市场上还没有应用于生物反应器大规模产业化生产组织工程活性皮肤的培 养液。目前现有的实验室用于组织工程皮肤研究的培养液在试剂的稳定性、细胞培养效果 及细胞培养的时间等方面存在明显的不足。而且配制过程使用过程操作繁琐复杂，不能用 于大规模皮肤细胞的培养，经检索，具有高稳定性，操作简单，能够用于生物反应器大规模 及产业化生产组织工程活性人工皮肤的培养液至今还没有见到公开资料。虽然目前有各种细胞培养液，但这些培养液一是成本高，二是不能用于大规模地 产业化地生产和培养。含有活化素A的本培养液及其配制方法目前没有报道。生物组织工程学是应用生命科学和组织工程学的原理与方法，研究发展用于修 复、增进或改善人体各种组织或器官损伤后功能和形态的一门新兴学科。是继细胞生物学 和分子生物学之后，生命科学发展史上又一个新的里程碑。生物组织工程的核心，是建立由 细胞和生物材料构成的三维空间复合体，其具体方法是将体外培养的高浓度的与功能相关 的活细胞种植于细胞外基质上(ECM)，然后移植到动物体内达到新的有功能的组织目的。与 传统的方法相比较，其最大的优点在于(1)形成具有生命力的活体组织，对损伤或病损组 织进行形态、结构和功能的重建并达到永久性替代；(2)可以用较少量的组织细胞(种子细 胞)经体外培养扩增后，来修复大块的组织缺损；(3)可按组织、器官缺损情况任意塑形，达 到完美的形态修复。将组织工程学应用于人工皮肤的研发和生产，将会带来极大的社会效益和经济效 益。据WHO统计，中国每年约有九百万烧烫伤病人的抢救治疗是目前临床上一大挑战，特别 是目前经济处于快速发展和转型时期，工伤和意外事故频繁发生，常常导致人体大面积烧 烫伤的发生。由于大面积深度烧烫伤，过多的全层皮肤毁坏，而导致屏障功能丧失及及免疫 调节失衡，产生感染，水电解质系乱等造成病人因脓毒症和脏器功能衰竭而死亡。因此，早 期创面覆盖和皮肤移植以减轻脱水和预防感染是目前临床上抢救治疗大面积烧烫伤病人 的主要措施。对于大面积烧烫伤病人，由于自体健康皮肤有限，临床上最初采用猪皮或异体 人类皮肤作为移植材料。但是免疫排斥反应使得移植皮肤难以成活。由此可见，烧烫伤病人皮肤移植所面临的挑战是皮源的紧张和免疫排斥反应。自体皮源不足是大面积烧烫伤病人救治过程中的难题。尽早在功能和外观上修复 创面对降低大面积烧烫伤病人的死亡率，提高生存质量和重返社会极为重要。因此，尽快地 突破组织工程人工皮肤大规模研发和生产的瓶颈，是关系到整个人类社会和经济发展的大 事情。该培养液的问世，从技术上解决了人工皮肤大规模化生产的难题，将极大地推动活性 人工皮肤的发展。目前已研制出各种不同功能的人工皮肤替代品，部分已经商品化并应用 于临床。皮肤由表皮，真皮和皮下组织组成，是人体最大的组织器官，也是人体最重要的器 官之一，它最重要的功能是屏障功能，保护人体免受外界的伤害，同时具有温度调节，感觉， 防止紫外线辐射等其他重要的功能。烧烫伤是一种常见的创伤，特别是大面积烧烫伤，如果 得不到及时的救治，病人将会发生体液流失，外来菌体入侵，因感染而死亡，而目前烧烫伤 还没有有效的治疗方法。烧烫伤最主要的治疗手段就是皮肤移植，而大面积烧烫伤病人缺 乏自己可利用的皮肤，没有足够的皮肤覆盖，将会危及病人的生命及引起一系列的并发症。 组织工程人工培养皮肤是一门具有非常广阔市场前景的学科，它解决了烧烫伤病 人自体皮源不足的难题，但是没有很好的皮肤细胞培养液，限制组织工程皮肤的发展，现有 的皮肤细胞培养液，不能进行大规模地组织工程皮肤生产及培养，往往仅限于实验室小规 模地培养，且细胞培养的周期长，成本大，耗材高，细胞的传代能力也很短暂，而本专利技术解决 了上述问题，是第一次公开了这种培养液可以用于大规模地组织工程皮肤培养及生产，该 培养液也可以应用于生物器技术进行大规模地生产和培养。本专利技术的培养液配方解决了组 织工程皮肤大规模生产的瓶颈问题，培养液配方在本领域是空白，经检索，尚未发现用于皮 肤产业化生产的含有活化素A的这种培养液的配方。本专利技术的培养液可用于生物反应器， 进行皮肤细胞培养，能进行大规模地产业化生产，降低生产成本。同时也可用于无血清培 养，这样生产出来的产品更加安全，同时也降低了生产成本，配制的培养液保存期更长，可 以长期保存，能够大规模地生产和配制。本专利技术还第一次公开了将活化素A用于人类皮肤细胞培养液，经检索，没有任何 人将活化素A加入培养液当中，因此具有很强的创新性。活化素A又称为激活素A、转化生长因子A，是在两栖动物胚胎中发现的中胚层诱 导因子，其生理功能相当广泛，包括中胚层诱导，血管再生，细胞分化等(参见附后的相关 参考文献)。现有培养液的缺点一是现配现用，时效性很差。二是含有小牛血清，成本高，风险 大，容易导致疾病的传播，比如疯牛病等。三是不包括我们培养液的特有物质，因此皮肤细 胞非常容易分化，细胞生长缓慢。四是培养液本身不能进行大规模地产业化配制。五是现 有的培养液不能应用于生物反应器技术。六是不能大规模地进行组织工程皮肤的产业化生 产，这是制约组织工程皮肤产业化的瓶颈。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种稳定性高，操作简单，能够大规模地进行皮肤细胞培养 的培养液及其配制方法，以及使用该培养液进行细胞培养后得到组织工程皮肤的方法。本 专利技术的另一个目的是在培养液中加入一种防止皮肤细胞早期分化的物殊物质活化素A(即转化生长因子A)。 本专利技术用于大规模组织工程皮肤培养的培养液含有如下组分细胞生长因子 3-30ng/mL、胰岛素2_30 μ g/mL、氢化可的松0. 2-0. 6 μ g/mL、垂体提取物3_30 μ g/mL、钙离 子 0. 5-5. 5mmol/L、转铁蛋白 3_30 μ g/mL、青霉素 20_60U/mL、链霉素 20_60mg/mL、活化素 A 0. l-0.9ng/mL。该培养液的具体配制方法如下第一步，将商用的F12粉剂和DMEM粉剂分 别配制成F12培养液和DMEM培养液；第二步，将得到的两种培养液按照F12培养液体积百 分数为15-25%、DMEM培养液体积百分数为75-85%且两者的体积百分数总和为100%的 比例进行充分混合得到两者的混合液，其中所用F12和DMEM培养液的比例分别在上述范围 内自由选择；第三步，在得到的混合液中加入细胞生长因子、胰岛素、氢化可的松、垂体提取 物、可溶钙盐、转铁蛋白、青霉素、链霉素和活化素A，使最终得到的混合培养液中各组分的 含量如下细胞生长因子3-30ng/mL、胰岛素2_30 μ g/mL、氢化可本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于大规模产业化生产皮肤细胞的含活化素Ａ的培养液，其含有如下组分：细胞生长因子３－３０ｎｇ／ｍＬ、胰岛素２－３０μｇ／ｍＬ、氢化可的松０．２－０．６μｇ／ｍＬ、垂体提取物３－３０μｇ／ｍＬ、钙离子０．５－５．５ｍｍｏｌ／Ｌ、转铁蛋白３－３０μｇ／ｍＬ、青霉素２０－６０Ｕ／ｍＬ、链霉素２０－６０ｍｇ／ｍＬ、活化素Ａ０．１－０．９ｎｇ／ｍＬ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：朱宁文，
申请(专利权)人：朱宁文，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]