植物营养成分含量的快速提取检测法制造技术

本发明专利技术提供一种植物，尤指大豆多基因聚合育种杂交后代营养成分含量快速检测法，包括水溶性物质异黄酮和脂溶性物质维生素Ｅ、叶黄素、胡萝卜素等物质的一次取样同时提取，以及ＨＰＬＣ两步分析法，实现了“一次取样，多种功能性营养成分可同步分析检测”，进而加快育种后代选拔进程，培育高附加值大豆新品种，同时也可以缩短检测时间，降低人力、物力、财力的投入，减少检测废弃物的对环境的污染。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种植物营养成分、尤其是大豆的功能性营养成分含量的快速提取检 测方法，特别涉及一种能同步快速地提取大豆多基因聚合育种杂交后代的功能性营养成 分，并借助HPLC所具有的检测功能，对其进行定性、定量的方法，由此可快速对其杂交后代 进行筛选。
技术介绍
许多植物种子，尤其大豆种子不仅富含优质的植物性蛋白质和脂肪酸，而且也含 有异黄酮、维生素E等多种功能性营养成分。尤其是近年来，随着生活水平的提高，消费者 对大豆异黄酮、维生素E等功能性营养成分的需求急剧上涨。但是，在现有的已育成推广 的大豆品种中，尚没有综合农艺性状好，异黄酮、维生素E等功能性营养成分含量均高的品 种，极大地影响了大豆本身的加工利用价值，降低了深加工企业的经济效益。利用大豆基因聚合杂交育种手段，将控制异黄酮、维生素E、叶黄素等功能性营养 成分含量的基因，聚合到同一个基因组中，从而培育出异黄酮、维生素E及叶黄素含量都高 的大豆新品种，提高大豆综合利用价值。现有的维生素E (Tocopherol)提取分析技术有多 种，过去常用Emmerie-Engel法(EE法)、荧光法、薄层层析法(TLC法)等。近年来，随着高效 液相色谱(HPLC)技术的不断改良，利用液相色谱分析技术基本可以对维生素E的四个同分 异构体 a -Tocopherol ( a -生育酚)、^ -Tocopherol ( 3 -生育酚)、y -Tocopherol ( Y -生 育酚)和S-Tocopherol(S-生育酚)进行简单的定性定量分析(DellaPenna，2005， Ujiieet al.，2005)。同样做为类胡萝卜素一种的叶黄素(Lutein —种强抗氧化物质，白内 障、老年型黄斑变性症的预防)(Monma et al.，1994，Kanamaru et al.，2006)，以及女性荷 尔蒙样物质的异黄酮(Isoflavone)提取分析技术，近年来常用高效液相色谱法(HPLC)进 行定性及定量分析(王春娥等，1998，Wang 1994)。这些现有的维生素E、叶黄素以及异黄酮分析技术，在受检样品数、质量不受限的 前提下，均可对大豆种子进行种子维生素E、叶黄素以及异黄酮进行定性定量分析。但是，传 统方法需要样品的数量或质量多，提取步骤繁琐，费时费力费试剂，对环境污染大。问题是 在基因聚合后的杂交后代每粒种子的功能性营养成分含量检测选拔方面，由于这些现有的 异黄酮、维生素E和叶黄素的分析检测技术，都是各自独立的分析系统，1次取样只能支持 上述1种营养成分的选拔。要想知道每一粒珍贵的杂交后代种子的上述两种或三种成分的 含量，必须分两次或三次分别取样(每次>20mg)，分别进行HPLC的定性定量分析。而杂种 后代每粒种子的质量较小，而且一粒种子具有的性状都各不相同，若利用现有技术对其多 次取样分析后，即便从中选出符合育种目标的杂交后代种子，由于种子被多次取样切除，将 剩余部分种子播种后，终因不能正常出苗而无法完成下个世代增殖繁育，进而无法实现预 期的育种目标。以维生素E和叶黄素杂交聚合育种后代为例，因具有高维生素E(母本14_16g/100 粒)和高叶黄素(6-8g/100粒)含量的亲本百粒重均较小，杂交前期世代的单粒种子质量，3只有60-100mg左右，经过两次取样分析筛选后，即便获得维生素E和叶黄素含量双高的 后代，也会因种子自身被过多的切除而失去后代繁育能力，进而无法实现预期的育种目标 (Wang et al.，2007)。而且，检测未成熟大豆子叶中维生素E等的含量时，因种子中很多成分正处于形 成期或处于欲检测成分的前驱体状态，用传统的方法检测时，会检出很多的未知的相互粘 连的峰，根本无法定性目标峰，更无法准确定量目标成分的含量。限制了未成熟大豆子叶中 很多酶基因的表达解析，及关联基因标记的开发。因此，在大豆(植物)多基因聚合杂交育种后代选拔过程中，迫切需要一种只进行 “一次取样，多种功能性营养成分可同步提取、检测的技术”。该问题一旦解决，不仅为大豆 品质改良育种工作者解决了“育种瓶颈”，也为谷物、食品检测等领域，提供了便利的检测方 法，降低了检测成本，减少了人财物的浪费及环境污染。
技术实现思路
为了解决大豆功能性营养成分基因聚合育种杂交后代个体选拔过程中，存在的在 同一世代的同一粒种子，含有的多种目标成分，无法同时进行定量检测分析的难题，本专利技术 的目的在于提供一种提取检测方法，以实现“一次取样，多种功能性营养成分可同步提取、 检测”，进而加快育种后代选拔进程，培育高附加值大豆新品种；同时也为了缩短检测时间， 降低人力、物力、财力的投入，减少检测废弃物的对环境的污染。本专利技术通过对现有的维生素E、叶黄素以及异黄酮提取技术以及HPLC分析技术的 改进，实现了上述目的，采用的技术方案如下本专利技术提供一种植物，具体如大豆的营养成分含量的快速提取和检测法，该方法 特别适用于大豆多基因聚合杂交育种后代营养成分含量的快速提取和检测，也可用于测定 食品中的维生素E、异黄酮、叶黄素、胡萝卜素、叶绿素a，b等成分含量，该方法包括如下步 骤1、水溶性物质异黄酮和脂溶性物质维生素E、叶黄素等类胡萝卜素物质的一次取 样同时提取，制备样品；2、HPLC两步分析法。其中所述的提取是用低温冷藏条件下的正己烷试剂将欲检测的植物种子微量样 品中的维生素E、叶黄素等类胡萝卜素物质溶出后，剩余物再用乙醇试剂溶出异黄酮。优选的，所述植物是杂交大豆，特别是大豆多基因聚合杂交育种后代，所述低温是 0-4°C ；所述正己烷是化学纯试剂，其用量为250-500 yl ；所述种子微量样品是5_10mg，优 选种子碎末；所述乙醇是70-80%乙醇，其用量为250-500 ill。优选的，所述正己烷试剂中含有0. 25 u g/ml的3 -阿朴胡萝卜素醛和3 u g/ml母 育酚作为内部标准物。优选的，所述提取是将欲检测的种子逐粒用裁纸刀片，在种脐的正相反侧的子叶 部位切取碎末加入离心管，同时加入含有阿朴胡萝卜素醛和母育酚内部标准的所述正 己烷试剂，振荡器振荡10-20秒后，4°C下超声波超声8-10分钟，之后遮光冷藏静置15-30 分钟后，离心10分钟，取上清液300-400 u 1得到维生素E、叶黄素等类胡萝卜素HPLC分析 样品；再取沉淀加入70-80%乙醇试剂，振荡器振荡10-20秒，超声波超声8-10分钟，之后室温静置15-30分钟后，离心10分钟，取上清液300-400 u 1得到异黄酮HPLC分析样品。其中所述HPLC两步分析法包括1)维生素E及叶黄素等类胡萝卜素的HPLC检测 和2)异黄酮的HPLC检测。1)维生素E及叶黄素等类胡萝卜素的HPLC(Hitachi LaChrom Elite, HitachiHigh-Technologies Crop.，Japan)检测条件为使用 0DS-3 逆向柱，柱温为 40°C, UV检测器波长在200-900nm之间可用，进样量为25-30 yl，移动相A为75%的甲醇溶液， 移动相B为乙酸乙酯，移动相A与移动相B的体积比为50-60 50-40 ；采用线性梯度法检 测，流速设定为0. 8ml/min。其中检测维生素E用UV波长为29本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种植物营养成分含量的快速提取检测法，包括如下步骤：水溶性物质异黄酮和脂溶性物质维生素Ｅ、叶黄素等类胡萝卜素物质的一次取样同时提取，制备样品；ＨＰＬＣ两步分析法。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王绍东，冯晓，王晓云，李文滨，喜多村启介，朱秀清，李远明，富校轶，刘伟，姜妍，王浩，刘燕，李宏伟，张平，姚磊，
申请(专利权)人：黑龙江省大豆技术开发研究中心，
类型：发明
国别省市：93[中国|哈尔滨]