【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物。更具体地，涉及膜蛋白ralb在鉴别与区分猪x精子方面的应用，具体是利用猪精子膜蛋白ralb在x精子细胞的表面差异性地表达，区分或鉴别猪x和y精子的应用。
技术介绍
1、动物的性别控制(sex control)技术是通过对动物的正常生殖过程进行人为干预，使成年雌性动物产出人们期望性别后代的一门生物技术。性别控制技术在畜牧生产中意义重大。首先，通过控制后代的性别比例，可充分发挥受性别限制的生产性状(如泌乳)和受性别影响的生产性状(如生长速度、肉质等)的最大经济效益。其次，控制后代的性别比例可增加选种强度，加快育种进程。通过控制胚胎性别还可克服牛胚胎移植中出现的异性孪生不育现象，排除伴性有害基因的危害。性别控制可以通过精子分离或胚胎性别鉴别来实现。
2、目前现有的性别控制技术包括在精子发生过程中通过基因编辑技术改变产生x精子和y精子的比例、根据x精子和y精子的大小、活力、电荷、表面抗原和dna含量等方面的差异分离成熟精子、通过改变雌性生殖道环境来筛选最终到达卵母细胞的精子以及通过早期胚胎鉴定来筛选体外胚胎的性别。但是由于成本昂贵、现有技术受限等问题，大部分的技术仍然停留在实验室阶段，无法在畜牧业生产实践中使用。流式细胞仪分选精子技术是目前最为成功的精子分选技术，已经广泛运用于奶牛的生产实践中。然而在养猪业中，很少使用流式细胞仪分选精子，因为在流式细胞仪分选的过程中猪精子的细胞膜被破坏，导致其活力、受精能力、体外保存的能力下降。此外，母猪单次输精的量比较大，通常比牛需要的高得多。因此，目前急需一种新的方法
3、膜蛋白，通常是指细胞膜上的蛋白，约占细胞膜成分的30％，是生物膜功能的主要承担者。如果可以鉴定x、y精子膜上的差异性蛋白，那么就可以针对其通过抗原抗体反应(蛋白免疫法)或膜蛋白受体信号刺激分选x、y精子。相较于流式细胞分选，该方法简单易行，能够满足生猪产业单次输精量的需求且分选过程中对精子细胞的有害影响较少。已有研究通过maldi-tof-ms(chen x,j proteomics.2012,77:59-67)、nuplc-ms/ms(de caniom,molecular biosystems.2014,10(6))等蛋白组学技术对牛x、y精子差异性蛋白进行了鉴定。然而，在猪中目前未有成功验证的性别差异性精子膜蛋白报告。
技术实现思路
1、本专利技术要解决的技术问题是探索一种猪x精子上的差异性蛋白，从而利用该蛋白在x精子细胞的表面差异性地表达，更简单易行地鉴别猪x精子和猪y精子。
2、本专利技术的目的是提供一种猪精子膜蛋白ralb在鉴别或区分猪x精子和猪y精子中的应用。
3、本专利技术另一目的是提供一种鉴别猪x精子和猪y精子的方法。
4、本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：
5、本专利技术提供了猪精子膜蛋白ralb在鉴别或区分猪x精子和猪y精子中的应用，所述鉴别或区分的方法为利用ralb蛋白在x精子细胞的表面差异性地表达的特性进行鉴别或区分，该蛋白在x精子的表达高于y精子。
6、优选地，膜蛋白ralb在x精子的表达量比在y精子的表达量高50％以上。
7、更优选地，膜蛋白ralb在x精子的表达量比在y精子的表达量高53％以上。
8、具体地，所述猪精子膜蛋白ralb的氨基酸序列在uniprot数据库中对应的蛋白id：i3lv17。
9、具体地，编码所述的ralb蛋白的基因的核苷酸序列在ncbi数据库上对应的基因id：100624229。
10、本专利技术还提供了一种鉴别猪x精子和猪y精子的方法，所述鉴别方法为利用ralb蛋白在x精子细胞的表面差异性地表达的特性进行鉴别或区分，该蛋白在x精子的表达显著高于y精子。
11、优选地，所述鉴定方法为以ralb蛋白为分子标记，检测ralb蛋白的表达量，通过ralb蛋白表达量的差异进行判断。
12、更具体地，膜蛋白ralb在x精子的表达量比在y精子的表达量高50％以上。
13、更具体地，膜蛋白ralb在x精子的表达量比在y精子的表达量高53％以上。
14、更优选地，检测ralb蛋白的表达量的鉴定方法为蛋白质印迹法或免疫荧光法。
15、更具体地，所述蛋白质印迹法检测ralb蛋白表达量的步骤如下：
16、s1、对经过xy精子分离后的两种精液样品分别提取膜蛋白，测定精子的蛋白浓度；
17、s2、使精子蛋白变性，采用10％质量比的sds-page凝胶电泳分离膜蛋白；
18、s3、将步骤s2获得的胶片转移至硝酸纤维素膜上；用缓冲液将膜洗涤，随后用含5％质量比的脱脂奶粉的tbst缓冲液在室温条件下封闭1h～2h；
19、s4、用缓冲液将膜洗涤，加入ralb抗体和gapdh抗体，4℃过夜；然后再次用缓冲液洗涤，然后用二抗在室温条件下孵育1h～2h；
20、s5、用缓冲液洗涤，随后使用低背景化学发光检测试剂盒进行了印迹曝光，然后统计印迹的灰度值。
21、更优选地，s2中蛋白变性方法为：取含有30μg精子蛋白作为上样量，加入17％体积比的6×protein loading buffer和mem-pertmplus增溶缓冲液补至20μl，99℃孵育10min。
22、更优选地，缓冲液为tbst溶液，再加入溶液0.1％体积的tween20。
23、更优选地，s4使用的二抗为辣根过氧化物酶标记山羊抗兔igg(h+l)
24、更优选地，s5使用的发光试剂盒为cecl western blot kit。
25、更优选地，s5使用的统计软件为image j。
26、作为一些可选择的实施方案，ralb蛋白在猪育种中的应用：
27、1、鉴定猪x和y精子的方法，包含如下步骤：以ralb蛋白为分子标记，采用蛋白质印迹法或免疫荧光鉴定猪x和y精子，其中，ralb蛋白在x精子细胞的表面差异性地表达。
28、2、分离猪x和y精子的方法，包含如下步骤：以ralb蛋白为抗原或受体，采用抗体抗原反应或配体反应差异性改变猪x或y精子的功能，从而分离x或y精子，其中，ralb蛋白在x精子细胞的表面差异性的表达。
29、本专利技术具有以下有益效果：
30、本专利技术利用dia蛋白组学技术发现了在x精子膜蛋白中差异性表达的猪精子膜蛋白ralb，其可以作为分离猪x、y精子的差异性标识蛋白。该蛋白既可以作为分子标记，也可以作为蛋白免疫法的抗原或作为配体作用的受体改变精子功能从而分离x、y精子，有望实现一种低成本、高效、简便的精子性别分选方法，有助于畜牧业的可持续发展，有助于缓解未来粮食紧缺问题也有助于解决一系列动物福利问题，具有重要的应用价值。
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1.猪精子膜蛋白RALB在鉴别或区分猪X精子和猪Y精子中的应用，其特征在于，所述鉴别或区分的方法为利用RALB蛋白在X精子细胞的表面差异性地表达的特性进行鉴别或区分，该蛋白在X精子的表达高于Y精子。
2.根据权利要求1所述应用，特征在于，膜蛋白RALB在X精子的表达量比在Y精子的表达量高50％以上。
3.根据权利要求1所述应用，特征在于，所述猪精子膜蛋白RALB的氨基酸序列在Uniprot数据库对应的蛋白ID：I3LV17。
4.根据权利要求1所述应用，特征在于，编码所述的RALB蛋白的基因的核苷酸序列在NCBI数据库上对应的基因ID：100624229。
5.一种鉴别猪X精子和猪Y精子的方法，其特征在于，利用RALB蛋白在X精子细胞的表面差异性地表达的特性进行鉴别或区分，该蛋白在X精子的表达显著高于Y精子。
6.根据权利要求5所述方法，特征在于，所述鉴定方法为以RALB蛋白为分子标记，检测RALB蛋白的表达量，通过RALB蛋白表达量的差异进行判断。
7.根据权利要求6所述方法，特征在于，检测RALB蛋白的表
8.根据权利要求6所述方法，特征在于，检测RALB蛋白的表达量的方法为免疫荧光法。
9.根据权利要求6所述方法，特征在于，膜蛋白RALB在X精子的表达量比在Y精子的表达量高50％以上。
10.根据权利要求9所述方法，特征在于，膜蛋白RALB在X精子的表达量比在Y精子的表达量高53％以上。
...【技术特征摘要】
1.猪精子膜蛋白ralb在鉴别或区分猪x精子和猪y精子中的应用，其特征在于，所述鉴别或区分的方法为利用ralb蛋白在x精子细胞的表面差异性地表达的特性进行鉴别或区分，该蛋白在x精子的表达高于y精子。
2.根据权利要求1所述应用，特征在于，膜蛋白ralb在x精子的表达量比在y精子的表达量高50％以上。
3.根据权利要求1所述应用，特征在于，所述猪精子膜蛋白ralb的氨基酸序列在uniprot数据库对应的蛋白id：i3lv17。
4.根据权利要求1所述应用，特征在于，编码所述的ralb蛋白的基因的核苷酸序列在ncbi数据库上对应的基因id：100624229。
5.一种鉴别猪x精子和猪y精子的方法，其特征在于，利用ralb...
【专利技术属性】
技术研发人员：洪林君，吴珍芳，吴昌华，谢言射，张献伟，蔡更元，李紫聪，顾婷，杨化强，郑恩琴，徐铮，黄思秀，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：
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