【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于真菌检测，具体涉及一种用于检测三唑类药物耐药烟曲霉的组合物、方法及应用。
技术介绍
1、侵袭性曲霉病(invasive aspergillosis，ia)是一种由曲霉感染引起的疾病，病原菌包括烟曲霉、黄曲霉、构巢曲霉、土曲霉和黑曲霉等，其主要发生于因癌症化疗、骨髓移植或免疫系统疾病导致免疫功能低下的人群中。ia已经成为各种重症免疫受损机体中最常见的机会性感染，也是患者致死的最主要原因。
2、目前临床治疗ia的主要药物包括三唑类、多烯类以及棘白菌素类。其中，三唑类药物又包括伊曲康唑、伏立康唑等。随着侵袭性曲霉病发病的日益增多，病原真菌对三唑类药物的耐药性也逐渐增加。曲霉对唑类药物的耐药现象最早由英国曼彻斯特大学的daviddenning团队于1997年报道。针对三唑类耐药烟曲霉菌株的检测，可进一步指导真菌感染的治疗，对于临床上选择恰当的抗真菌药物，具有十分重要的意义。
3、由于临床样本的培养阳性率非常低，分子检测方法是检测唑类耐药菌株的重要工具。目前三唑类耐药曲霉的分子检测手段非常有限，只有一小部分技术人员对其进行了研究。例如2008年guillermo等人建立了一种位点特异分子信标的方法(allele-specificmolecularbeacons)检测cyp51a基因g54、g138、m220、l98以及tr34突变位点，每个反应的模板量为1ng基因组dna。2010年许辉等人描述了一种利用snp分型检测cyp51a基因g54r、m220i、l98h、g138c的方法。2011年denn
4、现有技术中部分专利报道了烟曲霉唑类耐药突变检测的方法，如cn106591440a中国专利技术专利公开了一种用于烟曲霉唑类耐药突变检测的核酸诊断试剂盒及其检测方法，该专利技术针对烟曲霉的耐药突变tr34/l98h，开发了一套曲霉耐药检测方法。然而现有的检测方法在耐药菌株与敏感菌株混合感染时，难以实现耐药菌株的微量检测，检测限较高，灵敏度和特异性均有所欠缺。并且现有检测方法均只针对于三唑类药物靶酶cyp51a基因，而无检测烟曲霉hmg1基因相关耐药突变的方法。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利建立了一种针对cyp51a基因和hmg1基因相关耐药突变来实现耐药烟曲霉菌株有效检测的新方法，并且该方法灵敏度高、特异性强，对于临床快速诊断和指导临床用药具有重要意义。
2、本专利技术的目的之一在于提供一种用于检测三唑类药物耐药烟曲霉的组合物。
3、为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
4、用于检测三唑类药物耐药烟曲霉的组合物，所述组合物包括如下引物探针组合中的任一种或多种：
5、(1)组合1：包括用于检测烟曲霉cyp51a_l98h突变位点的引物对a、探针a和mgb封闭寡核苷酸a；所述引物对a包含核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物a和seq idno.4所示的反向引物a，所述探针a的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述mgb封闭寡核苷酸a的核苷酸序列如seq id no.2所示；
6、(2)组合2：包括用于检测烟曲霉cyp51a_tr34突变位点的引物对b和探针b；所述引物对b包含核苷酸序列如seq id no.5所示的正向引物b和seq id no.7所示的反向引物b，所述探针b的核苷酸序列如seq id no.6所示；
7、(3)组合3：包括用于检测烟曲霉cyp51a_tr46突变位点的引物对c和探针c；所述引物对c包含核苷酸序列如seq id no.8所示的正向引物c和seq id no.7所示的反向引物c，所述探针c的核苷酸序列如seq id no.6所示；
8、(4)组合4：包括用于检测烟曲霉cyp51a_g54r突变位点的引物对d、探针d和mgb封闭寡核苷酸d；所述引物对d包含核苷酸序列如seq id no.9所示的正向引物d和seq idno.12所示的反向引物d，所述探针d的核苷酸序列如seq id no.11所示，所述mgb封闭寡核苷酸d的核苷酸序列如seq id no.10所示；
9、(5)组合5：包括用于检测烟曲霉cyp51a_g54w突变位点的引物对e、探针e和mgb封闭寡核苷酸e；所述引物对e包含核苷酸序列如seq id no.13所示的正向引物e和seq idno.16所示的反向引物e，所述探针e的核苷酸序列如seq id no.15所示，所述mgb封闭寡核苷酸e的核苷酸序列如seq id no.14所示；
10、(6)组合6：包括用于检测烟曲霉cyp51a_m220i突变位点的引物对f、探针f和mgb封闭寡核苷酸f；所述引物对f包含核苷酸序列如seq id no.17所示的正向引物f和seq idno.20所示的反向引物f，所述探针f的核苷酸序列如seq id no.19所示，所述mgb封闭寡核苷酸f的核苷酸序列如seq id no.18所示；
11、(7)组合7：包括用于检测烟曲霉cyp51a_y121f突变位点的引物对g、探针g和mgb封闭寡核苷酸g；所述引物对g包含核苷酸序列如seq id no.21所示的正向引物g和seq idno.24所示的反向引物g，所述探针g的核苷酸序列如seq id no.23所示，所述mgb封闭寡核苷酸g的核苷酸序列如seq id no.22所示；
12、(8)组合8：包括用于检测烟曲霉cyp51a_m263i突变位点的引物对h、探针h和mgb封闭寡核苷酸h；所述引物对h包含核苷酸序列如seq id no.25所示的正向引物h和seq idno.28所示的反向引物h，所述探针h的核苷酸序列如seq id no.27所示，所述mgb封闭寡核苷酸h的核苷酸序列如seq id no.26所示；
13、(9)组合9：包括用于检测烟曲霉hmg1_w272c突变位点的引物对i、探针i和mgb封闭寡核苷酸i；所述引物对i包含核苷酸序列如seq id no.29所示的正向引物i和seq idno.32所示的反向引物i，所述探针i的核苷本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.用于检测三唑类药物耐药烟曲霉的组合物，其特征在于，所述组合物包括如下引物探针组合中的任一种或多种：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述探针5’端标记FAM，3’标记MGB。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述MGB封闭寡核苷酸3’端修饰MGB。
4.用于检测三唑类耐药烟曲霉的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1-3任一项所述的组合物。
5.权利要求1所述的组合物在制备用于检测混合感染中的三唑类耐药烟曲霉的试剂和/或试剂盒中的应用，其特征在于，所述混合感染为三唑类耐药烟曲霉和三唑类敏感烟曲霉的混合感染。
6.利用权利要求1-3任一项所述的组合物定性和/或定量检测三唑类耐药烟曲霉的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，S2中，反应体系为DNA模板2μl、TaqPathProAmpMaster Mix 10μl、正向引物1.5μl、反向引物1.5μl、探针0.5μl、MGB封闭寡核苷酸1μl、无核酸酶水补至20μl；反应条件为：Sta
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述正向引物、反向引物、探针和MGB封闭寡核苷酸的浓度均为10μM。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，若所述实时荧光定量PCR得到扩增曲线且Ct值≤35，判定为三唑类药物耐药烟曲霉阳性；若无扩增曲线或Ct值＞35，判定为三唑类药物耐药烟曲霉阴性。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，烟曲霉cyp51A_L98H的线性方程为Y＝-3.485X+41.435；烟曲霉CYP51A_Y121F的线性方程为Y＝-3.312X+40.072；烟曲霉CYP51A_G54R的线性方程为Y＝-3.449X+42.315；烟曲霉CYP51A_G54W的线性方程为Y＝-3.555X+36.116；烟曲霉CYP51A_M220I的线性方程为Y＝-3.331X+38.631；烟曲霉CYP51A_TR34的线性方程为Y＝-3.402X+38.547；烟曲霉CYP51A_TR46的线性方程为Y＝-3.398X+39.002；烟曲霉CYP51A_M263I的线性方程为Y＝-3.327X+43.097；烟曲霉Hmg1_W272C的线性方程为Y＝-3.69X+49.317；烟曲霉Hmg1_E306K的线性方程为Y＝-3.314X+45.574；其中，Y为Y轴，表示模板量；X为X轴，表示CT值。
...【技术特征摘要】
1.用于检测三唑类药物耐药烟曲霉的组合物，其特征在于，所述组合物包括如下引物探针组合中的任一种或多种：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述探针5’端标记fam，3’标记mgb。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述mgb封闭寡核苷酸3’端修饰mgb。
4.用于检测三唑类耐药烟曲霉的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1-3任一项所述的组合物。
5.权利要求1所述的组合物在制备用于检测混合感染中的三唑类耐药烟曲霉的试剂和/或试剂盒中的应用，其特征在于，所述混合感染为三唑类耐药烟曲霉和三唑类敏感烟曲霉的混合感染。
6.利用权利要求1-3任一项所述的组合物定性和/或定量检测三唑类耐药烟曲霉的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，s2中，反应体系为dna模板2μl、taqpathproampmaster mix 10μl、正向引物1.5μl、反向引物1.5μl、探针0.5μl、mgb封闭寡核苷酸1μl、无核酸酶水补至20μl；反应条件为：stage1：95℃10min，1个循环；stage2：(92℃15s，
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，...
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。