【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及抗凝血酶ⅲ免疫层析测定，具体为一种抗凝血酶ⅲ免疫层析测定试剂盒及其制备方法。
技术介绍
1、不明原因复发性流产(ursa)是指在妊娠20周之前连续两次或两次以上妊娠丢失。ursa通常指发生在妊娠早期的流产，很少发生在妊娠晚期。随着工作压力的增加和快节奏的生活方式，ursa的发病率逐年上升，影响约1％-5％妊娠妇女。这种疾病会对身心健康造成严重影响，建议对此类患者进行干预。
2、ursa的发病机制尚不明确，有研究证实，染色体因素、子宫内膜因素、胎盘因素、解剖因素、免疫因素、感染和暴露于不良环境因素均可能诱发该疾病。血栓形成前状态与ursa的相关性引起了学者们的关注。我们发现，部分ursa患者在积极抗凝(蜕膜、胎盘绒毛、脐带血管血栓)后，仍能正常怀孕。然而，很少有研究探讨其潜在机制。at-iii和d-二聚体均是临床常用的与凝血有关的指标。
3、目前，对at-iii进行定量检测的方法可分为三类：免疫火箭电泳法、凝胶空斑法、发色底物法。其中，火箭电泳(rocket electrophoresis)又称电免疫扩散法。是将单向扩散与电泳技术相结合的一种方法。主要用于检测标本中某一免疫球蛋白含量。方法是将含有已知抗体的琼脂制成琼脂板。冷凝后，在液板上的阴极端挖一排小孔。孔中分别加入一定量的待检样品及不同稀释度的标准抗原，进行电泳。抗原向阳极移动，并与抗体结合。在抗原、抗体比例适当的部位形成锥形沉淀峰，其形状如火箭。该峰的高度与抗原量成正比。可快速测出标本中抗原的含量。本法的敏感度与单向琼脂扩散相仿，技术操
4、故本专利技术提供一种基于荧光免疫层析法的抗凝血酶ⅲ(at-iii)活性测定试剂盒，其价格低廉、全液体、试剂灵敏度高、特异性高、线性范围宽。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种抗凝血酶ⅲ免疫层析测定试剂盒及其制备方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
2、本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：
3、一种抗凝血酶ⅲ免疫层析测定试剂盒，包括试剂盒，所述试剂盒的内部卡设有检测卡，所述检测卡包括样品垫、结合垫1、结合垫2、nc膜和吸水纸，所述结合垫1和结合垫2上通过用喷金划膜仪喷涂有微球偶连物，所述nc膜通过喷金划膜仪进行at-iii抗原划线划线形成t1、t2线，所述nc膜上进行羊抗兔igg划线形成质控c线。
4、作为本专利技术进一步的方案：所述微球偶连物的制备步骤如下：
5、a1：微球偶连，用一定量的edc及nhs将荧光微球活化后，将微球与at-iii抗体按照如下比例进行偶连：1ml：15～20ug的at-iii抗体；
6、b2：微球封闭，将偶连好的微球及微球封闭液按照体积比2:1.2进行混合，将混合后的微球放置在37度水浴环境下偶连2～2.5h；
7、c3：微球的保存,将封闭好的微球与微球封闭液按照体积比3:1混合，混合完成后，将混合液放置在冰水浴中超声30s～1min，之后将偶连好的微球-at-iii抗体放置在2～8℃冰箱内保存。
8、作为本专利技术进一步的方案：所述微球封闭液的配方为在ph＝8.0±0.5的硼酸缓冲液内含有0.25％～1％的酪蛋白、0.5％～1％的蔗糖和0.25％～0.5％的海藻糖。
9、作为本专利技术进一步的方案：所述微球-at-iii抗体被稀释液稀释至10～15ug/ml的浓度，所述稀释液是在磷酸缓冲溶液内加入0.5％～1％的吐温20及0.8％～1％牛血清白蛋白(bsa)。
10、一种抗凝血酶ⅲ免疫层析测定试剂盒的制备方法，包含以下步骤：
11、s1：样品垫及结合垫处理液制备，在一定量的tris-hcl缓冲溶液内加入0.25％～0.5％的bsa；
12、s2：泡垫及干燥，在常温环境下，无菌托盘内装满样品垫及结合垫处理液，将样品垫或结合垫浸泡在处理液内，浸泡时间为2～4h。浸泡完成后，在湿度为20％～40％的环境下，将样品垫及结合垫自然晾干；
13、s3：微球偶连，用一定量的edc及nhs将荧光微球活化后，将微球与at-iii抗体按照如下比例进行偶连：1ml：15～20ug的at-iii抗体；
14、s4：微球封闭，将偶连好的微球及微球封闭液按照体积比2:1.2进行混合，将混合后的微球放置在37度水浴环境下偶连2～2.5h；
15、s5：微球的保存，将封闭好的微球与微球封闭液按照体积比3:1混合，混合完成后，将混合液放置在冰水浴中超声30s～1min，之后将偶连好的微球-at-iii抗体放置在2～8℃冰箱内保存；
16、s6：结合垫喷涂，将微球-at-iii抗体用稀释液稀释至10～15ug/ml的浓度后，用喷金划膜仪将微球偶连物喷涂至1.8cm宽度的结合垫上。将喷涂完成后的结合垫放置在37～42℃烘箱中6～8h烘干；
17、s7：nc膜的划线，用磷酸盐缓冲液配置成nc膜划线液，将待划线的at-iii抗原用划线液稀释至1～1.2mg/ml，羊抗兔igg稀释至1.2～1.5mg/ml，用喷金划膜仪将at-iii抗原划线至nc膜上，形成t1、t2线，再将羊抗兔igg划线至nc膜上形成质控c线，t1、t2线及c线划线划线完成后，将nc膜放置在37～42℃真空干燥箱中8h；
18、s8：检测卡的组装，将样品垫、结合垫1、结合垫2、nc膜和吸水纸按顺序组装；
19、s9：检测，取待测血清90～110ul与血清稀释液1800～220ul混合，滴加进检测卡的检测孔内，待8～10min后，用干式荧光免疫分析仪进行检测获得数据，其中血清稀释液的配方如下：在ph＝7.2～7.8的磷酸盐缓冲溶液内含有1％～5％的hbr阻断剂，0.25％～0.5％的s9；
20、s10：试剂盒性能验证。
21、作为本专利技术进一步的方案：试剂盒性能验证步骤如下：
22、s10a:试剂盒的线性，取高值血清400ug/ml，用已知的0值血清对高值血清进行倍比稀释，得到200ug/ml、100ug/ml、50ug/ml、25ug/ml、0ug/ml
23、的样本，用已知的这六个样本分别进行点样，每个样本重复3次；
24、s10b:试剂盒的相对特异性，用建立的荧光免疫层析方法检测50份不同抗体效价的血清样本(来自于医院的真实样本，其中阳性样本35例，阴性样本15例)，其结果与医院所给出的真实的病人情况做对比，相对特异性和总符合率，其计算公式如下：相对特异性(％)＝{阴性数/(阴性数+假阳性数)}×100％；...
【技术保护点】
1.一种抗凝血酶Ⅲ免疫层析测定试剂盒，包括试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的内部卡设有检测卡，所述检测卡包括样品垫、结合垫1、结合垫2、NC膜和吸水纸，所述结合垫1和结合垫2上通过用喷金划膜仪喷涂有微球偶连物，所述NC膜通过喷金划膜仪进行AT-III抗原划线划线形成T1、T2线，所述NC膜上进行羊抗兔IgG划线形成质控C线。
2.根据权利要求1所述的一种抗凝血酶Ⅲ免疫层析测定试剂盒，其特征在于，所述微球偶连物的制备步骤如下：
3.根据权利要求2所述的一种抗凝血酶Ⅲ免疫层析测定试剂盒，其特征在于，所述微球封闭液的配方为在PH＝8.0±0.5的硼酸缓冲液内含有0.25％～1％的酪蛋白、0.5％～1％的蔗糖和0.25％～0.5％的海藻糖。
4.根据权利要求2所述的一种抗凝血酶Ⅲ免疫层析测定试剂盒，其特征在于，所述微球-AT-III抗体被稀释液稀释至10～15ug/ml的浓度，所述稀释液是在磷酸缓冲溶液内加入0.5％～1％的吐温20及0.8％～1％牛血清白蛋白(BSA)。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的一种抗凝血酶Ⅲ免疫层析测定试剂盒的
6.根据权利要求5所述的一种抗凝血酶Ⅲ免疫层析测定试剂盒及其制备方法，其特征在于，试剂盒性能验证步骤如下：
...【技术特征摘要】
1.一种抗凝血酶ⅲ免疫层析测定试剂盒，包括试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的内部卡设有检测卡，所述检测卡包括样品垫、结合垫1、结合垫2、nc膜和吸水纸，所述结合垫1和结合垫2上通过用喷金划膜仪喷涂有微球偶连物，所述nc膜通过喷金划膜仪进行at-iii抗原划线划线形成t1、t2线，所述nc膜上进行羊抗兔igg划线形成质控c线。
2.根据权利要求1所述的一种抗凝血酶ⅲ免疫层析测定试剂盒，其特征在于，所述微球偶连物的制备步骤如下：
3.根据权利要求2所述的一种抗凝血酶ⅲ免疫层析测定试剂盒，其特征在于，所述微球封闭液的配方为在ph＝8.0±0.5的硼酸缓冲...
【专利技术属性】
技术研发人员：李志会，余旭亮，汪雪琴，
申请(专利权)人：安徽恩禾生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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