【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程，尤其涉及一种提高氨甲酰妥布霉素发酵产量的构建方法和应用。
技术介绍
1、streptoalloteichus tenebrarius(2008年前名为streptomyces tenebrarius，黑暗链霉菌)(int j syst evol microbiol 2008,58,3,688-691)是一种重要的链霉菌，通过发酵可以获得氨甲酰妥布霉素、氨甲酰卡那霉素和安普霉素，工业上常将其发酵产物通过碱水解以及分离纯化的方式生产妥布霉素(j antibiot 1973,26,12,745-751)。为减小工业生产中分离纯化过程的成本投入，通过对主要副产物安普霉素生物合成途径中相关基因(例如aprj)进行敲除，可以阻断安普霉素的合成(肖剑萍.暗霉素定向生物合成研究[d].福州大学,2014.)。
2、妥布霉素(tobramycin)，又名妥布拉霉素，属于第二类氨基糖苷类抗生素。妥布霉素能够与细菌核糖体的30s亚基上的氨酰基trna识别位点结合，阻止70s复合体的形成，阻碍翻译的进行，影响肽链的伸长，造成密码的错读，产生异常蛋白，从而杀死细菌(naturecommunications 2015,6)。妥布霉素是一种广谱高效抗生素，在动物实验中，妥布霉素的耳毒性和肾毒性相比庆大霉素更低。临床上主要治疗部分严重感染，如革兰氏阴性菌绿脓杆菌、大肠杆菌及肺炎杆菌等所引起的烧伤感染、败血症、呼吸系统感染、泌尿系统感染、胆囊胆道感染及软组织严重感染等疾病(nat prod rep 2013,30,1,11-2
3、氨基糖苷类抗生素通常由链霉菌和小单胞菌产生，与其他大多数抗生素相似，属于放线菌产生的次级代谢产物。放线菌中抗生素的代谢合成通常受到途径特异性或全局性调控蛋白的作用，通过对相关调控蛋白的研究改造，可以精准调控放线菌的次级代谢过程，从而影响抗生素的产量。本专利技术的目的就是通过基因工程定向改变基因来获得氨甲酰妥布霉素高产菌株，用于妥布霉素的工业生产。
4、lrp/asnc家族转录调控因子广泛存在于细菌和古细菌中，lrp/asnc家族调控蛋白功能广泛，大多数都参与调控氨基酸代谢和小分子的转运(mol microbiol2003,48,2,287-294)。基于基因序列推测，tobr基因属于lrp/asnc家族，经申请实验室研究发现，s.tenebrarius的tobr可能是一个参与氨甲酰妥布霉素生物合成的负调控因子，且emsa实验证明tobr蛋白能与其相邻基因tobo的启动子区域dna直接结合。
5、基于s.tenebrarius的tobo基因序列比对分析结果，推测tobo属于taud/tfda家族蛋白，是一种α-酮戊二酸依赖的氧化酶，可能会通过参与氨基酸的分解代谢从而对菌体的次级代谢产生影响，经申请实验室研究发现，过表达s.tenebrarius的tobo基因后能促进氨甲酰妥布霉素的发酵生产。
6、为了进一步提高氨甲酰妥布霉素的发酵水平，需要一种通过s.tenebrarius的tobr基因和tobo基因提高氨甲酰妥布霉素发酵产量、降低生产成本的产业化方法。
技术实现思路
1、本专利技术所需要解决的技术问题在于提供一种提高氨甲酰妥布霉素产量的方法。
2、本专利技术采用以下技术方案解决上述技术问题。
3、第一方面，本专利技术提供了一种提高氨甲酰妥布霉素产量的方法：通过基因工程技术在s.tenebrarius中失活tobr基因，和/或在s.tenebrarius中过表达taud/tfda家族氧化酶的编码基因，获得氨甲酰妥布霉素高产菌株，并将其用于氨甲酰妥布霉素的发酵生产；其中tobr基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，核苷酸序列编码的氨基酸序列如seq idno.2所示；所述s.tenebrarius为敲除aprj基因的s.tenebrarius。
4、根据本专利技术的实施方式，所述在s.tenebrarius中失活tobr基因的方法为：在s.tenebrarius中敲除tobr基因。
5、根据本专利技术的实施方式，所述在s.tenebrarius中失活tobr基因的方法为：
6、(a)以s.tenebrarius基因组为模板，分别设计引物对扩增tobr基因的上、下游同源臂片段；
7、(b)将tobr基因上下游同源臂片段进行融合；
8、(c)以tobr基因上下游同源臂片段的融合产物与敲除质粒载体片段重组，得到tobr基因的敲除质粒；
9、(d)将tobr基因敲除质粒导入大肠杆菌et12567(puz8002)，然后通过接合转移的方式导入s.tenebrarius中，待其完成两轮同源重组交换后，筛选得到缺失tobr基因的突变株。
10、根据本专利技术的实施方式，所述taud/tfda家族氧化酶的编码基因为tobo基因，tobo基因的核苷酸序列如seq id no.3所示或如seq id no.3所示的核苷酸序列经一个或多个碱基的替换得到的编码相同功能蛋白的核苷酸序列，tobo基因的核苷酸序列编码蛋白质的氨基酸序列如seq id no.4所示或如seq id no.4所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸碱基的替换得到同功能氨基酸序列。
11、根据本专利技术的实施方式，所述s.tenebrarius采用链霉菌强启动子过表达tobo基因。
12、根据本专利技术的实施方式，过表达tobo基因的方法为：
13、(a)以s.tenebrarius基因组为模板，扩增tobo的基因片段；
14、(b)将tobo的基因片段与带有链霉菌强启动子的整合型过表达载体进行重组，得到tobo的过表达质粒；
15、(c)将tobo的过表达质粒先导入大肠杆菌et12567(puz8002)，然后通过接合转移的方式导入s.tenebrarius，筛选得到整合型过表达tobo基因的突变株。
16、所述步骤(c)中的s.tenebrarius优选为缺失tobr基因的s.tenebrarius突变株，步骤(c)最终筛选得到的突变株优选为缺失tobr基因同时过表达tobo基因的s.tenebrarius突变株。
17、第二方面，本专利技术提供了一种氨甲酰妥布霉素高产菌株，所述菌株通过以下方法构建：采用基因工程技术在s.tenebrarius中失活tobr基因，和/或在s.tenebrarius中过表达taud/tfda家族氧化酶的编码基因，获得氨甲酰妥布霉素高产菌株；其中tobr基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，核苷酸序列编码的氨基酸序列如seq id no.2所示。
18、优选的，所述taud/tfda家族氧化酶的编码基因为tobo基因，tobo基因的核苷酸序列如seq id no.3所示或如seq id no.3所示的核苷酸序列经一个或多个碱基的替换得到的编码相同功能蛋白的核苷酸序列，ttobo基因本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种提高氨甲酰妥布霉素产量的方法，其特征在于，通过基因工程技术在S.tenebrarius中失活tobR基因，和/或在S.tenebrarius中过表达TauD/TfdA家族氧化酶的编码基因，获得氨甲酰妥布霉素高产菌株，并将其用于氨甲酰妥布霉素的发酵生产；其中tobR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述S.tenebrarius为敲除aprJ基因的S.tenebrarius。
2.根据权利要求1所述提高氨甲酰妥布霉素产量的方法，其特征在于，所述在S.tenebrarius中失活tobR基因的方法为：在S.tenebrarius中敲除tobR基因。
3.根据权利要求1所述提高氨甲酰妥布霉素产量的方法，其特征在于，所述在S.tenebrarius中失活tobR基因的方法为：
4.根据权利要求1所述提高氨甲酰妥布霉素产量的方法，其特征在于，所述TauD/TfdA家族氧化酶的编码基因为tobO基因，tobO基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示或如SEQID NO.3所示的
5.根据权利要求4所述提高氨甲酰妥布霉素产量的方法，其特征在于，所述S.tenebrarius采用链霉菌强启动子过表达tobO基因。
6.根据权利要求4所述提高氨甲酰妥布霉素产量的方法，其特征在于，过表达tobO基因的方法为：
7.根据权利要求6所述提高氨甲酰妥布霉素产量的方法，其特征在于，所述步骤(c)中的S.tenebrarius优选为缺失tobR基因的S.tenebrarius突变株，步骤(c)最终筛选得到的突变株优选为缺失tobR基因同时过表达tobO基因的S.tenebrarius突变株。
8.氨甲酰妥布霉素高产菌株，其特征在于，所述菌株通过以下方法构建：采用基因工程技术在S.tenebrarius中失活tobR基因，和/或在S.tenebrarius中过表达TauD/TfdA家族氧化酶的编码基因，获得氨甲酰妥布霉素高产菌株；其中tobR基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，核苷酸序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
9.根据权利要求8所述氨甲酰妥布霉素高产菌株，其特征在于，所述TauD/TfdA家族氧化酶的编码基因为tobO基因，tobO基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示或如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列经一个或多个碱基的替换得到的编码相同功能蛋白的核苷酸序列，ttobO基因的核苷酸序列编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示或如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸碱基的替换得到同功能氨基酸序列。
10.权利要求8或9所述的氨甲酰妥布霉素高产菌株在氨甲酰妥布霉素生产中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种提高氨甲酰妥布霉素产量的方法，其特征在于，通过基因工程技术在s.tenebrarius中失活tobr基因，和/或在s.tenebrarius中过表达taud/tfda家族氧化酶的编码基因，获得氨甲酰妥布霉素高产菌株，并将其用于氨甲酰妥布霉素的发酵生产；其中tobr基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，核苷酸序列编码的氨基酸序列如seq id no.2所示；所述s.tenebrarius为敲除aprj基因的s.tenebrarius。
2.根据权利要求1所述提高氨甲酰妥布霉素产量的方法，其特征在于，所述在s.tenebrarius中失活tobr基因的方法为：在s.tenebrarius中敲除tobr基因。
3.根据权利要求1所述提高氨甲酰妥布霉素产量的方法，其特征在于，所述在s.tenebrarius中失活tobr基因的方法为：
4.根据权利要求1所述提高氨甲酰妥布霉素产量的方法，其特征在于，所述taud/tfda家族氧化酶的编码基因为tobo基因，tobo基因的核苷酸序列如seq id no.3所示或如seqid no.3所示的核苷酸序列经一个或多个碱基的替换得到的编码相同功能蛋白的核苷酸序列，tobo基因的核苷酸序列编码蛋白质的氨基酸序列如seq id no.4所示或如seq id no.4所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸碱基的替换得到同功能氨基酸序列。
5.根据权利要求4所述提高氨甲酰妥布霉素产量的方法，其特征在于，所述s.tenebrarius采用...
【专利技术属性】
技术研发人员：林建平，冯赟，蒋亦琪，朱力，吴绵斌，杨立荣，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。