【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于医疗检测及试剂，具体涉及一种基于差异甲基化位点筛查21-三体胎儿的生物标志物，并进一步公开筛选该差异甲基化位点的方法及其制备21-三体产前筛查试剂盒的用途。
技术介绍
1、唐氏综合征也称为21-三体综合征(t21)，是目前最常见的智力残疾形式之一，通常是由21号染色体的全部或部分第三拷贝的存在引起的。据统计，每800-1000例新生胎儿中约有1例发生唐氏综合征病变。鉴于唐氏综合征目前无法治疗，仅能通过产前诊断或筛查进行提前诊断及人工流产，因此，相关产前检测技术的开发是重中之重。
2、目前，唐氏综合征的临床筛查试验包括超声颈部半透明测量和血清标记物分析，但其方法准确率较低。此外，临床产前筛查的手段还包括唐氏筛查、羊水穿刺等，但这些检测方法却都存在一些固有缺陷，影响唐氏筛查准确率偏低，只能作为预筛选手段。此外，羊水穿刺虽然是检测的金标准但却有流产的风险。
3、随着母体血浆中循环无细胞胎儿dna的发现，为无创产前筛查开辟了新的可能性。目前，应用cffdna检测三体综合征已经开发出几种适应性策略。数字聚合酶链式反应(pcr)和大规模平行基因组测序是对胎盘和母体dna片段的单分子进行计数的方法，并且能够检测由于非整倍性导致的dna的最小增量。然而，大规模平行测序的长周期和高成本阻碍了其在临床上的常规使用。
4、与此同时，以差异甲基化位点作为检测标志物与数字聚合酶链式反应(pcr)相结合进行产前三体筛查的方法也被开发出来。有开发者根据hlcs或c21orf25与rassf1a的比率，来进行基
技术实现思路
1、为此，本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种用于21-三体产前筛查的生物标志物，所述生物标志物可以实现对产前21-三体的精准筛查；
2、本专利技术所要解决的第二个技术问题在于提供一种筛选胎儿与母体差异甲基化位点的标准方法，能够方便而准确地筛选并评估差异甲基化程度，并配合荧光定量pcr、数字pcr来实现对产前21-三体的筛查；
3、本专利技术所要解决的第二个技术问题在于提供一种用于21-三体产前筛查的产品，尤其是试剂盒产品，用于产前的唐氏筛查。
4、为解决上述技术问题，本专利技术所述的一种用于21-三体产前筛查的生物标志物，所述生物标志物包括差异甲基化位点cd48、c2cd2以及aatbc的组合物；
5、优选的，所述生物标志物还包括差异甲基化位点ripk4、umodl1、erg、ets2或dscam中的至少一个。
6、具体的，所述的用于21-三体产前筛查的生物标志物，所述生物标志物包括差异甲基化位点cd48、ripk4、c2cd2、umodl1和aatbc的组合物。
7、具体的，所述的用于21-三体产前筛查的生物标志物，所述生物标志物包括差异甲基化位点erg、cd48、ets2、dscam、c2cd2和aatbc的组合物。
8、本专利技术还公开了所述差异甲基化位点cd48、ripk4、c2cd2、umodl1和aatbc的组合物或者差异甲基化位点erg、cd48、ets2、dscam、c2cd2和aatbc的组合物用于制备21-三体产前筛查生物标志物的用途。
9、本专利技术还公开了一种所述用于21-三体产前筛查的生物标志物的筛选方法，包括如下步骤：
10、采集未孕成人女性静脉血并提取全基因组，记为npw；
11、收集培养三体胎儿滋养层细胞，并提取全基因组，分别得到来自怀孕整倍体妇女的整倍体胎儿滋养层细胞样本pt和来自怀孕非整倍体妇女的t21胎儿滋养层细胞样本tpt；
12、取pt dna和npw dna用甲基化敏感性限制酶hpa ii进行消化，使用qpcr及数字pcr对msre hpa ii消化前后的基因组dna进行扩增，从中选取胎儿发生甲基化而母亲未发生甲基化的位点；
13、按照如下方式计算△△ct：△△ctnpw-pt＝(ctcutnpw-ctuncutnpw)-(ctcutpt-ctuncutpt)，△△ct越大，差异甲基化程度越高，即为目标生物标志物。
14、具体的，所述用于21-三体产前筛查的生物标志物的筛选方法，还包括对筛选的生物标志物进行优化筛选的步骤；
15、所述优化筛选的步骤包括通过方差分析处理获取数据的步骤以及筛选差异显著的位点组成检测位点的步骤；其中，
16、对于荧光定量pcr，chr21上染色体相对于常染色体上的基因丰度变化程度使用以下方式来衡量：△△ctchr21-chr1＝(ctcutchr21-ctuncutchr21)-(ctcutchr1-ctuncutchr1)，foldchange＝2-△△ctchr21-chr1；
17、对于数字pcr，foldchange＝△△cchr21/chr1＝(ccutchr21/ccutchr1)/(cuncutchr21/cuncutchr1)，使用方差分析测试eccfdna及tccfdna获得的foldchange数据，检测位点特异性；
18、所述筛选差异显著的位点组成检测位点的步骤，还包括按照如下公式进行累计计算的步骤：
19、
20、当y值>n且越高时，三体概率越高。
21、本专利技术还公开了一种用于21-三体产前筛查的产品，所述产品的扩增检测体系包括扩增所述生物标志物的特异性引物、甲基化敏感性限制性内切酶hpaii、qpcr预混液、阳性对照以及阴性对照；
22、优选的，所述用于21-三体产前筛查的产品包括试剂盒。
23、本专利技术还公开了一种用于21-三体产前筛查的msre-qpcr试剂盒，所述试剂盒包括可以特异性扩增所述差异甲基化位点erg、cd48、ets2、dscam、c2cd2和aatbc的6组特异性扩增引物，以及甲基化敏感性限制性内切酶hpaii、qpcr预混液、阳性对照、阴性对照。
24、具体的，所述的用于21-三体产前筛查的msre-qpcr试剂盒，所述可以特异性扩增所述差异甲基化位点erg、cd48、ets2、dscam、c2cd2和aatbc的6组特异性扩增引物包括：
25、特异性扩增erg的引物包括：
26、forward primer(5'->3')：acctttgcatgtgagaggca；
27、reverse primer(5'->3')：gtcgagccagcgtcttttat；
28、特本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于21-三体产前筛查的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物包括差异甲基化位点CD48、C2CD2以及AATBC的组合物；
2.根据权利要求1所述的用于21-三体产前筛查的生物标志物，其特征在于：
3.一种差异甲基化位点CD48、RIPK4、C2CD2、UMODL1和AATBC的组合物或者差异甲基化位点ERG、CD48、ETS2、DSCAM、C2CD2和AATBC的组合物用于制备21-三体产前筛查生物标志物的用途。
4.一种权利要求1或2所述用于21-三体产前筛查的生物标志物的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
5.根据权利要求4所述用于21-三体产前筛查的生物标志物的筛选方法，其特征在于，还包括对筛选的生物标志物进行优化筛选的步骤；
6.一种用于21-三体产前诊断的产品，其特征在于，所述产品的扩增检测体系包括扩增所述生物标志物的特异性引物、甲基化敏感性限制性内切酶HpaII、qPCR预混液、阳性对照以及阴性对照；
7.一种用于21-三体产前筛查的MSRE-qPCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包
8.根据权利要求7所述的用于21-三体产前筛查的MSRE-qPCR试剂盒，其特征在于，所述可以特异性扩增所述差异甲基化位点ERG、CD48、ETS2、DSCAM、C2CD2和AATBC的6组特异性扩增引物包括：
9.一种用于21-三体产前筛查的MSRE-dPCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括可以特异性扩增所述差异甲基化位点CD48、RIPK4、C2CD2、UMODL1和AATBC的5组特异性扩增引物，以及甲基化敏感性限制性内切酶HpaII、dPCR预混液、阳性对照、阴性对照。
10.根据权利要求9所述用于21-三体产前筛查的MSRE-dPCR试剂盒，其特征在于，所述可以特异性扩增所述差异甲基化位点CD48、RIPK4、C2CD2、UMODL1和AATBC的5组特异性扩增引物包括：
...【技术特征摘要】
1.一种用于21-三体产前筛查的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物包括差异甲基化位点cd48、c2cd2以及aatbc的组合物；
2.根据权利要求1所述的用于21-三体产前筛查的生物标志物，其特征在于：
3.一种差异甲基化位点cd48、ripk4、c2cd2、umodl1和aatbc的组合物或者差异甲基化位点erg、cd48、ets2、dscam、c2cd2和aatbc的组合物用于制备21-三体产前筛查生物标志物的用途。
4.一种权利要求1或2所述用于21-三体产前筛查的生物标志物的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
5.根据权利要求4所述用于21-三体产前筛查的生物标志物的筛选方法，其特征在于，还包括对筛选的生物标志物进行优化筛选的步骤；
6.一种用于21-三体产前诊断的产品，其特征在于，所述产品的扩增检测体系包括扩增所述生物标志物的特异性引物、甲基化敏感性限制性内切酶hpaii、qpcr预混液、阳性对照以及阴性对照；
7.一种用于21-三体产前筛查的msre-qpc...
【专利技术属性】
技术研发人员：殷建，蔺春茂，尹焕才，王坦，
申请(专利权)人：中国科学院苏州生物医学工程技术研究所，
类型：发明
国别省市：
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