一种荧光定量PCR方法的肠道菌群定量检测试剂盒技术

技术编号：40079897 阅读：5 留言：0更新日期：2024-01-17 02:26

本发明专利技术涉及微生物检测技术领域，且公开了一种荧光定量PCR方法的肠道菌群定量检测试剂盒，包括：荧光定量PCR反应液、菌株标准品、对照品。荧光定量PCR反应液包含PCR反应缓冲液、特异性上下游引物、特异性探针。PCR反应缓冲液含氯化镁和三磷酸脱氧核糖核酸混合物、耐热Taq DNA聚合酶。对照品分阴性对照和阳性对照，阴性对照为高压灭菌的焦碳酸二乙酯处理水，阳性对照为标准菌株的阳性质粒样品。比传统的普通PCR和单重荧光定量PCR方法更简便、快速和准确，对检测的微生物进行实时准确定量，为临床上疑似肠道微生态紊乱，肠道疾病患者早期明确诊断，以便及时制定治疗方案。

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【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物检测，具体为一种荧光定量pcr方法的肠道菌群定量检测试剂盒。

技术介绍

1、目前，国内比较常见，也比较成熟的两种肠道菌群基因检测方法，分别是：方法1是基于pcr的16s-rdna扩增子测序法、方法2是宏基因组测序法、方法3是rt-qpcr(荧光定量pcr)法。对比现有的微生物检测方法，方法1和方法2虽然成熟可靠，成本相对较低，适合大规模数据建模和统计分析使用，适合用来分析肠道菌群的多样性，推测出菌群的变化，可知样品中的优势菌群，探讨菌群与疾病的关系，也可用来猜测不同种的细菌等优点。但是，由于扩增子测序上机检测需要大量时间，数据占用的电脑空间很大，仪器昂贵，不利于该技术在市场上普及。技术层面上由于需要先经过一轮pcr扩增，对样品中的dna片段进行富集来放大信号，这样就很容易在处理时遗漏掉一些本来含量较低，但对人体可能有较大影响的细菌。

2、方法3pcr技术在食品安全检测中的应用和推广提升了食品安全检测的准确性和安全系数，对比以往的食品检测方法，pcr技术在肠道菌群检测中的应用和推广提升了微生物检测的准确性和安全系数。pcr技术可以有效缩短检测时间，节约检测成本。但是，也存在以下缺点：pcr具有极高的敏感度，同时也造成pcr易出现假阳性问题，扩增产物污染既是最严峻，也是最简单发生的；pcr扩增溶液中存在的抑制pcr反应的成分，会造成pcr易出现假阴性问题。虽然方法3有以上的的缺陷，然而因其敏感度高、特异性强、特别是迅速快捷简便、成本低廉，有利于在医学微生物检测方面进行推广和广泛应用。

技术实现思路

1、(一)解决的技术问题

2、针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种荧光定量pcr方法的肠道菌群定量检测试剂盒，相比传统方法更简便、快速和准确。

3、(二)技术方案

4、一种荧光定量pcr方法的肠道菌群定量检测试剂盒包括：荧光定量pcr反应液、菌株标准品、对照品。

5、优选的，所述荧光定量pcr反应液包含pcr反应缓冲液、特异性上下游引物、特异性探针。

6、优选的，所述pcr反应缓冲液含氯化镁和三磷酸脱氧核糖核酸混合物、耐热taqdna聚合酶。

7、优选的，所述对照品分阴性对照和阳性对照，阴性对照为高压灭菌的焦碳酸二乙酯处理水，阳性对照为标准菌株的阳性质粒样品。

8、优选的，所述细菌的获取和培养方式为粪便中提取和从中国微生物菌种保藏中心购买标准；所述提取方法为使用稀释倒平板法，涂布平板法，平板划线法和稀释摇管法，并将培养的细菌做全基因组的检测，确定细菌所属的菌属，临床样本来源于近期患者的粪便标本，样本采集后低温保存并及时运送到实验室。

9、优选的，所述特异性探针和引物的设计包括ncbi基因库上下载了世界各地的目标菌属的序列，对其进行同源性比较，在对应基因组的保守基因区设计特异性引物与taqman探针，使用idt等网站，筛选和设计针对于每一个菌属的特异性引物和探针，并通过pcr筛选实验，优化单一菌株的引物，单一引物合并到一个反应体系中，通过溶解曲线，产物凝胶电泳和产物sanger测序法，确保pcr产物为目标菌属。

10、优选的，所述细菌dna提取为采用德国qiagen公司的qiaamp dna mini kit，按试剂盒说明书提取得到细菌dna，利用nanodrop nd-1000spectrophotometer在230nm、260nm和280nm测量细菌dna的浓度和纯度从而确定dna的拷贝数以备用。

11、优选的，所述细菌定量标准为选择荧光检测模式fam、hex、rox、cy5，荧光基线调整取3-15个循环的荧光信号平均值，阈值设定以阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点，样本呈典型的扩增曲线，判断为阳性，无典型的扩增曲线，判断为阴性；体系的优化试验，在以相同浓度阳性核酸为模板的反应体系中，引物浓度从0.10～1.00μm探针浓度从0.1005μm，采用知阵法优选引物和探针的最佳浓度，根据最低ct值和最高荧光强度增加值(δrn)选择最佳引物和探针浓度。

12、(三)有益的技术效果

13、本产品提供一种肠道菌群有益菌四重荧光定量pcr检测试剂盒，针对以下肠道菌群的菌属进行检测：双歧杆菌属、乳酸菌属、鼠李糖乳杆菌、酪酸梭菌、瘤胃球菌属、柔嫩梭菌属、拟杆菌属、埃希氏菌属、幽门螺旋杆菌、艰难梭菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、绿脓杆菌、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、志贺菌和肠球菌。由荧光定量pcr反应液、菌株标准品若干、对照品组成，其中荧光定量pcr反应液包含pcr反应缓冲液(含氯化镁和三磷酸脱氧核糖核昔酸混合物、耐热taqdna聚合酶)、特异性上下游物和探针。

14、本产品通过qpcr反应，可以从标本中检测出目的微生物的存在，与现有的技术相比有以下的优点：

15、1、比传统的普通pcr和单重荧光定量pcr方法更简便、快速和准确。本产品确定目的菌属的检测靶区、合成质粒，具有质量控制样本，阳性样本和阴性样本，可以保证检测的准确性。每个种属设计至少4-5组引物探针可以保证产品，并且对引物探针进行检测限、特异性、重复性、精密度、冻融等指标进行优化，保证了产品的准确性。

16、2、对检测的微生物进行实时准确定量，为临床上疑似肠道微生态紊乱，肠道疾病患者早期明确诊断，以便及时制定治疗方案，补充相应的益生菌，益生元，后生元等，减少死亡率。

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【技术保护点】

1.一种荧光定量PCR方法的肠道菌群定量检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括：荧光定量PCR反应液、菌株标准品、对照品。

2.根据权利要求1所述的一种荧光定量PCR方法的肠道菌群定量检测试剂盒，其特征在于：所述荧光定量PCR反应液包含PCR反应缓冲液、特异性上下游引物、特异性探针。

3.根据权利要求2所述的一种荧光定量PCR方法的肠道菌群定量检测试剂盒，其特征在于：所述PCR反应缓冲液含氯化镁和三磷酸脱氧核糖核酸混合物、耐热Taq DNA聚合酶。

4.根据权利要求1所述的一种荧光定量PCR方法的肠道菌群定量检测试剂盒，其特征在于：所述对照品分阴性对照和阳性对照，阴性对照为高压灭菌的焦碳酸二乙酯处理水，阳性对照为标准菌株的阳性质粒样品。

5.根据权利要求1所述的一种荧光定量PCR方法的肠道菌群定量检测试剂盒，其特征在于：所述细菌的获取和培养方式为粪便中提取和从中国微生物菌种保藏中心购买标准；所述提取方法为使用稀释倒平板法，涂布平板法，平板划线法和稀释摇管法，并将培养的细菌做全基因组的检测，确定细菌所属的菌属，临床样本来源于近期患者的

6.根据权利要求1所述的一种荧光定量PCR方法的肠道菌群定量检测试剂盒，其特征在于：所述特异性探针和引物的设计包括NCBI基因库上下载了世界各地的目标菌属的序列，对其进行同源性比较，在对应基因组的保守基因区设计特异性引物与Taqman探针，使用IDT等网站，筛选和设计针对于每一个菌属的特异性引物和探针，并通过PCR筛选实验，优化单一菌株的引物，单一引物合并到一个反应体系中，通过溶解曲线，产物凝胶电泳和产物sanger测序法，确保PCR产物为目标菌属。

7.根据权利要求1所述的一种荧光定量PCR方法的肠道菌群定量检测试剂盒，其特征在于：所述细菌DNA提取为采用德国QIAGEN公司的QIAamp DNAMini Kit，按试剂盒说明书提取得到细菌DNA，利用NanoDrop ND-1000Spectrophotometer在230nm、260nm和280nm测量细菌DNA的浓度和纯度从而确定DNA的拷贝数以备用。

8.根据权利要求1所述的一种荧光定量PCR方法的肠道菌群定量检测试剂盒，其特征在于：所述细菌定量标准为选择荧光检测模式FAM、HEX、ROX、CY5，荧光基线调整取3-15个循环的荧光信号平均值，阈值设定以阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点，样本呈典型的扩增曲线，判断为阳性，无典型的扩增曲线，判断为阴性；体系的优化试验，在以相同浓度阳性核酸为模板的反应体系中，引物浓度从0.10～1.00μM探针浓度从0.1005μM，采用知阵法优选引物和探针的最佳浓度，根据最低Ct值和最高荧光强度增加值(ΔRn)选择最佳引物和探针浓度。

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【技术特征摘要】

1.一种荧光定量pcr方法的肠道菌群定量检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括：荧光定量pcr反应液、菌株标准品、对照品。

2.根据权利要求1所述的一种荧光定量pcr方法的肠道菌群定量检测试剂盒，其特征在于：所述荧光定量pcr反应液包含pcr反应缓冲液、特异性上下游引物、特异性探针。

3.根据权利要求2所述的一种荧光定量pcr方法的肠道菌群定量检测试剂盒，其特征在于：所述pcr反应缓冲液含氯化镁和三磷酸脱氧核糖核酸混合物、耐热taq dna聚合酶。

4.根据权利要求1所述的一种荧光定量pcr方法的肠道菌群定量检测试剂盒，其特征在于：所述对照品分阴性对照和阳性对照，阴性对照为高压灭菌的焦碳酸二乙酯处理水，阳性对照为标准菌株的阳性质粒样品。

5.根据权利要求1所述的一种荧光定量pcr方法的肠道菌群定量检测试剂盒，其特征在于：所述细菌的获取和培养方式为粪便中提取和从中国微生物菌种保藏中心购买标准；所述提取方法为使用稀释倒平板法，涂布平板法，平板划线法和稀释摇管法，并将培养的细菌做全基因组的检测，确定细菌所属的菌属，临床样本来源于近期患者的粪便标本，样本采集后低温保存并及时运送到实验室。

6.根据权利要求1所述的一种荧光定量pcr方法的肠道菌群定量检测试剂盒，其特征在于：所述特异性探针和引物的设计包括ncbi基因库上下载了世界各地的目标菌属的序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：张茂好，
申请(专利权)人：中科基因科技山东有限公司，
类型：发明
国别省市：

全部详细技术资料下载我是这个专利的主人