【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种农残检测，特别涉及一种基于抑制柠檬酸银漆酶活性的乐果比色快检方法及酶片。
技术介绍
1、乐果(dimethoate,dmt)是高效广谱的杀螨剂，广泛应用于经济作物和生产中。其过量使用后会在水、土壤和植物组织中残留积累，与人类接触后导致人体内乙酰胆碱大量蓄积，中枢神经系统及胆碱能神经过度兴奋以致神经、呼吸、生殖和肝脏异常。由于农药广泛残留于蔬菜与水果中，中国农业农村部规定(gb2763-2021)乐果在部分蔬菜中的最大残留量为500gkg-1。因此，构建出一种快速、便捷且灵敏度高的乐果残留检测方法迫在眉睫。
2、目前国内外对乐果的检测主要依赖于气相色谱(gc)、气相色谱-质谱联用(gc-ms)等大型仪器，尽管可以灵敏地测定较低浓度的乐果，但是存在样品仪器昂贵、对测试人员要求高、维护成本高等缺点。近年来，研究人员逐渐建立了一系列乐果检测方法，如酶联免疫试剂盒、电化学及比色法等。然而，现有乐果检测方法存在不可忽视的缺点，如抗体容易失活、酶抑制法等易受干扰、电化学需要依赖专业设备等。而比色法大多基于纳米酶自身的聚集效应或氧化酶、过氧化物酶活性，这些体系容易受其他条件影响，可能会导致检测结果不准确。因此，迫切需要开发新的材料或模拟酶活性来建立灵敏且便捷的乐果快速检测新方法，这对在线监测食品中乐果残留和防范农药中毒具有重要意义。
技术实现思路
1、本专利技术要解决的技术问题之一提供一种操作简单、灵敏度高、检测速度快、成本低、不受检测设备限制的基于抑制柠檬酸银漆酶活
2、为了解决上述技术问题，本专利技术的技术方案为：
3、一种基于抑制柠檬酸银漆酶活性的乐果比色快检方法，包括以下步骤：
4、(1)绘制乐果浓度与吸光度值及灰度值变化量的标准曲线；
5、(2)根据乐果浓度与吸光度值及灰度值变化量标准曲线建立有关乐果浓度与吸光度值及灰度值变化之间相互关系的回归方程；
6、(3)制备未知乐果浓度的待测溶液，得c品；
7、(4)取c品测定其510nm波长处的吸光度值，获得其吸收光谱；或用软件处理得到区域灰度值，计算c品与a2品及b品的吸光度值及灰度值差值，将该吸光度值及灰度值差值代入线性回归方程中，即可获得c品中乐果的浓度。
8、进一步的，步骤1具体包括：
9、s1：取多支刻度离心管，每支刻度离心管加入一定浓度的柠檬酸银(agcit)溶液，然后每支刻度离心管对应加入一种已知浓度的乐果标准液，反应一段时间后，加入hepes缓冲液，最后加入2,4-二氯苯酚(2,4-dp)、4-氨基安替比林(4-aap)即可制备得到待测组，为a1品；
10、s2：取1支刻度离心管，用超纯水替代已知浓度的乐果标准液，按照a1方法即可制备得到空白对照溶液，为a2品；
11、s3：取a1品和a2品进行吸收光谱扫描，测定其在510nm波长处的吸光度值，获得其吸收光谱；
12、s4：根据吸收光谱，将不同浓度的a1品与a2品之间的吸光度差值作为纵坐标，乐果浓度作为横坐标绘制乐果吸光度变化量标准曲线；
13、此时步骤2中的线性回归方程为，y1＝0.017c0.20，y1为吸光度差值＝含乐果的待测品的吸光度值－a2品的吸光度值，c为乐果浓度。
14、进一步的，步骤1具体包括：
15、a：取一定浓度的agcit固定在纸片上，制备出乐果比色快检酶片，然后在酶片上加入已知浓度的乐果标准液，反应一定时间后，滴加hepes缓冲液，最后滴加2,4-二氯苯酚(2,4-dp)、4-氨基安替比林(4-aap)、即可制备得到待测组，为a品；
16、b：取已经固定好agcit的酶片，用超纯水替代已知浓度的乐果标准液，按照步骤a制备得到空白对照组，为b品；
17、c：取a品和b品，分别拍照后经软件处理得到区域灰度值；
18、d：根据灰度值，将不同浓度的a品与b品的灰度值差值作为纵坐标，乐果浓度作为横坐标绘制得到靶标浓度与灰度值变化量标准曲线；
19、此时步骤2中的线性回归方程为，y2＝0.017+0.94c，y2为灰度值差值＝含乐果的待测品灰度值值－b品灰度值，c为乐果浓度。
20、进一步的，步骤3具体包括：用实际样液替代步骤a中已知浓度的乐果标准液，即可制备得到未知靶标乐果浓度的待测溶液，为c品。
21、进一步的，柠檬酸银(agcit)溶液的浓度为0.02-0.12mg·ml-1；hepes缓冲液为5-30mm，ph 7.0-9.0；2,4-二氯苯酚(2,4-dp)溶液为0.02-0.12mg·ml-1；4-氨基安替比林(4-aap)溶液为0.02-0.06mg·ml-1。
22、进一步的，纸片类型为玻璃纤维素膜(ahlstrom 8964)。
23、本专利技术还提供了一种乐果比色快检酶片，将柠檬酸银(agcit)作为显色信号固定在载体膜上制成。
24、进一步的，载体膜为玻璃纤维素膜。
25、进一步的，柠檬酸银(agcit)以溶液的方式固定在载体膜上。
26、本专利技术的有益之处在于：
27、本专利技术的有益之处在于：
28、(1)本方法利用乐果抑制agcit的漆酶活性，并首次构建快检比色技术及酶片用于乐果的检测。
29、(2)本专利技术进一步将agcit作为显色信号固定在载体膜上制备了乐果可视化快检酶片，首次构建的基于漆酶模拟催化活性的乐果比色传感器及可视化快检酶片不仅为农药残留检测提供了新的方案，还拓宽了漆酶在其他物质检测中的应用。
30、(3)制备的乐果比色快检酶片平均回收率在88.0％-95.2％以内，相对标准差(rsd)范围为3.0％-7.9％，其检测性能与高效液相色谱法(hplc)分析结果相似，所提出的快速检测方法及酶片具有低成本、操作简单，可以通过替换相应的适配体扩展到检测其他感兴趣的目标。
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1.一种基于抑制柠檬酸银漆酶活性的乐果比色快检方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的基于抑制柠檬酸银漆酶活性的乐果比色快检方法，其特征在于，步骤1具体包括：
3.根据权利要求1所述的基于抑制柠檬酸银漆酶活性的乐果比色快检方法，其特征在于：步骤1具体包括：
4.根据权利要求3所述的基于抑制柠檬酸银漆酶活性的乐果比色快检方法，其特征在于：步骤3具体包括：用实际样液替代步骤a中已知浓度的乐果标准液，即可制备得到未知靶标乐果浓度的待测溶液，为C品。
5.根据权利要求2所述的基于抑制柠檬酸银漆酶活性的乐果比色快检方法，其特征在于：AgCit溶液的浓度为0.02-0.12mg·mL-1；HEPES缓冲液为5-30mM，pH 7.0-9.0；2,4-二氯苯酚溶液为0.02-0.12mg·mL-1；4-氨基安替比林溶液为0.02-0.06mg·mL-1。
6.根据权利要求3所述的基于抑制柠檬酸银漆酶活性的乐果比色快检方法，其特征在于：纸片类型为玻璃纤维素膜。
7.一种乐果比色快检酶片，其特征在于：将AgC
8.根据权利要求7所述的乐果比色快检酶片，其特征在于：所述载体膜为玻璃纤维素膜。
9.根据权利要求7所述的乐果比色快检酶片，其特征在于：AgCit以溶液的方式固定在载体膜上。
...【技术特征摘要】
1.一种基于抑制柠檬酸银漆酶活性的乐果比色快检方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的基于抑制柠檬酸银漆酶活性的乐果比色快检方法，其特征在于，步骤1具体包括：
3.根据权利要求1所述的基于抑制柠檬酸银漆酶活性的乐果比色快检方法，其特征在于：步骤1具体包括：
4.根据权利要求3所述的基于抑制柠檬酸银漆酶活性的乐果比色快检方法，其特征在于：步骤3具体包括：用实际样液替代步骤a中已知浓度的乐果标准液，即可制备得到未知靶标乐果浓度的待测溶液，为c品。
5.根据权利要求2所述的基于抑制柠檬酸银漆酶活性的乐果比色快检方法，其特征在于：agcit溶液的浓度为...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴远根，夏恋，韩建勋，林鑫，
申请(专利权)人：贵州谱尼测试技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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