【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及医药领域，特别是中药中真菌毒素的检测方法；
技术介绍
1、真菌毒素是由曲霉菌、镰刀菌以及青霉菌等真菌分泌的有毒代谢产物，主要包括黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和伏马毒素等，其具有多种毒性作用，例如肝毒性、肾毒性、致畸性、免疫抑制性、致突变性和致癌性等；作为一类特殊的农产品，中药材在种植、采收、加工以及贮藏等环节中均可能因操作不当而被真菌毒素污染；因此，检测和监控中药中的真菌毒素污染，并及时采取相应的防控措施，对于中药用药安全性具有重要意义；
2、选择合适的检测方法往往是整个分析中的关键步骤，其对提高检测专属性，灵敏度和检测效率非常重要；目前，可用于真菌毒素快速检测的方法主要包括酶联免疫分析、生物传感器、胶体金免疫层析试纸条等方法，其中酶联免疫分析法是目前应用最广泛的方法之一；然而传统酶联免疫分析法的灵敏度较低，而且抗基质干扰能力较差，在中药中真菌毒素定量分析应用过程中往往需要采用基质匹配标准曲线或者需要比较复杂的样品前处理方法；因此，本研究拟基于简便的直接竞争酶联免疫分析模式，利用au@pt纳米酶的易标记及拟酶活性的特性，并通过在au@pt纳米酶探针表面沉积金的方式，以形成au-au@pt合金结构，从而进一步改善au@pt纳米酶探针的催化活性，建立更简便、快速、灵敏、可抗复杂基质干扰的方法用于中药中真菌毒素的快速检测；
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种基于金增强au@pt纳米酶快速高灵敏检测中药中的真菌毒素的酶联免疫分析法，为中药的质量
2、本专利技术主要内容包括：首先将抗原包被在微孔板上，然后先将au@pt纳米探针稀释溶液与对照品溶液/样品溶液等体积混合孵育，再取部分转入上述已包被抗原并封闭的微孔板中继续孵育，洗去没有反应的au@pt纳米探针，加入金增强液。经金增强后，加入显色溶液进行显色。加入终止溶液终止反应，并在450nm处测得黄色产物的吸光度值。
3、本专利技术的方法步骤如下：
4、1、au@pt纳米探针的制备：
5、首先用k2co3溶液将au@pt溶液的ph调节至8.0，然后加入抗体。振荡15min后，加入25.0μl 10％ bsa(w/v)和25.0μl 1％ peg(w/v)溶液，继续振荡15min。在4℃及离心力15171g条件下离心10min以去除未结合的抗体。最后将au@pt-抗体探针用300μl的1％bsa0.1％ peg溶液复溶，并于4℃储存，备用。
6、2、直接竞争au@pt-elisa检测过程
7、首先，在酶标板孔中加入用包被液稀释的抗原溶液，于4℃孵育过夜。用pbst洗板三次，再加入封闭液(200μl/孔)，37℃孵育2h。然后先将稀释后的au@pt-抗体溶液与真菌毒素对照品溶液/样品溶液等体积混合后先于37℃孵育30min，再取部分混合液转入上述已包被抗原并封闭的微孔板中继续孵育30min。然后进行金增强。
8、3、金增强过程
9、本专利技术提出了低温高浓度一步金增强法、室温低浓度两步金增强法或低温低浓度两步金增强法，具体操作如下：
10、(1)低温高浓度一步金增强法：孵育结束后，pbst洗板四次，加入高浓度金增强液(5mm haucl4:10mm nh2oh·hcl＝1:1(v:v)，100μl/孔)，并在低温条件下孵育5min，用超纯水洗板四次；
11、(2)室温低浓度两步金增强法：孵育结束后，pbst洗板四次，加入相应金增强液(0.25mm haucl4:0.4mm nh2oh·hcl＝1:1(v:v)，100μl/孔)，室温孵育5min，用超纯水洗板四次，再加入低浓度增强液(0.25mm haucl4:0.4mm nh2oh·hcl＝1:1(v:v)，100μl/孔)，室温条件下孵育5min，用超纯水洗板四次。
12、(3)低温低浓度两步金增强法：孵育结束后，pbst洗板四次，加入相应金增强液(0.25mm haucl4:0.4mm nh2oh·hcl＝1:1(v:v)，100μl/孔)，低温条件下孵育10min，用超纯水洗板四次，再加入低浓度增强液(0.25mm haucl4:0.4mm nh2oh·hcl＝1:1(v:v)，100μl/孔)，低温条件下孵育10min，用超纯水洗板四次。
13、4、显色
14、经金增强后，加入显色溶液进行显色。显色反应15min后，每孔加入50μl终止溶液(1mol/l hcl)终止反应。在450nm处测得黄色产物的吸光度值。
15、本专利技术提供了一种高灵敏检测中药中的真菌毒素的检测方法，其特征在于将抗原包被在微孔板上，然后先将au@pt纳米探针稀释溶液与对照品溶液/样品溶液等体积混合孵育，再取部分转入上述已包被抗原并封闭的微孔板中继续孵育，洗去没有反应的au@pt纳米探针，加入金增强液；经金增强后，加入显色溶液进行显色；加入终止溶液终止反应，并在450nm处测得吸光度值；
16、具体检测方法如下：
17、au@pt纳米探针的制备：首先用k2co3溶液将au@pt溶液的ph调节至8.0，然后加入抗体；振荡，加入10％ bsa(w/v)和1％ peg(w/v)溶液，继续振荡；离心以去除未结合的抗体；最后将au@pt-抗体探针用1％ bsa 0.1％ peg溶液复溶，并储存备用；
18、直接竞争au@pt-elisa检测过程：首先，在酶标板孔中加入用包被液稀释的抗原溶液，于4℃孵育过夜；用pbst洗板三次，再加入封闭液，37℃孵育；然后先将稀释后的au@pt-抗体溶液与真菌毒素对照品溶液/样品溶液等体积混合后先于37℃孵育，再取部分混合液转入上述已包被抗原并封闭的微孔板中继续孵育；然后进行金增强；
19、金增强过程：采用低温高浓度一步金增强法、室温低浓度两步金增强法或采用低温低浓度两步金增强法，具体操作如下：
20、(1)低温高浓度一步金增强法：孵育结束后，pbst洗板四次，加入高浓度金增强液，并在低温条件下孵育，用超纯水洗板；
21、(2)室温低浓度两步金增强法：孵育结束后，pbst洗板四次，加入相应低浓度金增强液，室温孵育，用超纯水洗板，再加入低浓度增强液，室温条件下孵育，用超纯水洗板；
22、(3)低温低浓度两步金增强法：孵育结束后，pbst洗板四次，加入相应低浓度金增强液，低温孵育，用超纯水洗板，再加入低浓度增强液，低温条件下孵育，用超纯水洗板。
23、显色：经金增强后，加入显色溶液进行显色；每孔加入终止溶液终止反应；在450nm处测得吸光度值。
24、优选的，如上所述所述高浓度金增强液包含5mm haucl4:10mm nh2oh·hcl＝1:1(v:v)。
25、优选的，如上所述所述低浓度金增强液包含0.25mm haucl4:0.4mm 本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种高灵敏检测中药中的真菌毒素的检测方法，其特征在于将抗原包被在微孔板上，然后先将Au@Pt纳米探针稀释溶液与对照品溶液/样品溶液等体积混合孵育，再取部分转入上述已包被抗原并封闭的微孔板中继续孵育，洗去没有反应的Au@Pt纳米探针，加入金增强液；经金增强后，加入显色溶液进行显色；加入终止溶液终止反应，并在450nm处测得吸光度值；
2.如权利要求1所述的一种高灵敏检测中药中的真菌毒素的检测方法，其特征在于所述高浓度金增强液包含5mM HAuCl4:10mM NH2OH·HCl＝1:1(v:v)。
3.如权利要求1所述的一种高灵敏检测中药中的真菌毒素的检测方法，其特征在于所述低浓度金增强液包含0.25mM HAuCl4:0.4mM NH2OH·HCl＝1:1(v:v)。
4.如权利要求1-3任一项所述的一种高灵敏检测中药中的真菌毒素的检测方法，其特征在于所述抗体为ZEN抗体或AFB1抗体。
5.如权利要求1-3任一项所述的一种高灵敏检测中药中的真菌毒素的检测方法，其特征在于所述终止溶液为1mol/L HCl。
6.如权
7.如权利要求1-6任一项所述的一种高灵敏检测中药中的真菌毒素的检测方法，其特征在于所述真菌毒素为玉米赤霉烯酮或黄曲霉毒素。
8.如权利要求1-6任一项所述的一种高灵敏检测中药中的真菌毒素的检测方法，其特征在于具体操作步骤如下：
9.如权利要求1-6任一项所述的一种高灵敏检测中药中的真菌毒素的检测方法，其特征在于具体操作步骤如下：
10.如权利要求1-6任一项所述的一种高灵敏检测中药中的真菌毒素的检测方法，其特征在于具体操作步骤如下：
...【技术特征摘要】
1.一种高灵敏检测中药中的真菌毒素的检测方法，其特征在于将抗原包被在微孔板上，然后先将au@pt纳米探针稀释溶液与对照品溶液/样品溶液等体积混合孵育，再取部分转入上述已包被抗原并封闭的微孔板中继续孵育，洗去没有反应的au@pt纳米探针，加入金增强液；经金增强后，加入显色溶液进行显色；加入终止溶液终止反应，并在450nm处测得吸光度值；
2.如权利要求1所述的一种高灵敏检测中药中的真菌毒素的检测方法，其特征在于所述高浓度金增强液包含5mm haucl4:10mm nh2oh·hcl＝1:1(v:v)。
3.如权利要求1所述的一种高灵敏检测中药中的真菌毒素的检测方法，其特征在于所述低浓度金增强液包含0.25mm haucl4:0.4mm nh2oh·hcl＝1:1(v:v)。
4.如权利要求1-3任一项所述的一种高灵敏检测中药中的真菌毒素的...
【专利技术属性】
技术研发人员：张磊，王淑美，黄仁堂，赵祥升，刘聪敏，黄雨心，
申请(专利权)人：广东药科大学，
类型：发明
国别省市：
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