【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
1、成簇规则间隔短回文重复序列(crispr)和crispr相关(cas)蛋白的应用使基因组编辑成为可能，从而彻底改变了分子生物学。crispr介导的基因编辑是一种强大而实用的工具，具有创建新科学工具、纠正临床相关突变以及工程改造新的基于细胞的免疫疗法的潜力。病毒递送载体和电穿孔已成为免疫细胞中基于crispr的编辑的两种策略。然而，基因治疗领域一直存在着与病毒递送载体有关的复杂问题。
2、操纵t细胞、造血干细胞和诱导多能干细胞的能力为免疫工程化提供了科学工具和潜在的治疗途径。在人类细胞中发现crispr-cas基因编辑之前，针对免疫系统的基因治疗几乎完全依赖于病毒载体诸如逆转录病毒和慢病毒，通过(半)随机基因组整合插入转基因。然而，由于插入到原癌基因中和对病毒载体致命的全身免疫反应，临床试验产生了意想不到的后果，例如白血病。尽管病毒载体得到了改进，可以最大限度地减少遗传损伤和免疫反应，但病毒插入(诸如临床上用于生成car-t细胞的慢病毒)可能会导致基因过表达，例如不受内源调控的基因的过表达，从而限制了该方法的临床应用。
3、已经描述了非病毒crispr-cas基因编辑。然而，使用此类系统的编辑效率和/或可行性通常较低。例如，使用当前方法增加编辑效率是以降低细胞活力为代价的，反之亦然。需要改进的非病毒crispr-cas基因编辑方法，诸如具有改进的编辑效率和活力的方法。
技术实现思路
1、本文提供了一种用于修饰靶核酸的组合物，其包含：(a)可靶向
2、本文还提供了一种用于修饰靶核酸的组合物，其包含：(a)crispr-cas rna引导的核酸酶；(b)供体引导rna(grna)；和(c)质粒供体模板，其包含：(i)同源定向修复(hdr)模板；(ii)第一共递送线性化(cdl)靶序列，其中第一cdl靶序列可操作地连接至hdr模板的5'；和(iii)第二cdl靶序列，其中第二cdl靶序列可操作地连接至hdr模板的3'，并且其中(1)供体grna包含与第一cdl靶序列和第二cdl靶序列中的每一者互补的至少17个核苷酸，并且(2)第一cdl靶序列和第二cdl靶序列中的每一者可操作地连接至位于cdl靶序列3'的3碱基对原型间隔区相邻基序(pam)，并且其中所述组合物被配制用于以非病毒方式递送到细胞中。
3、本文还提供了一种用于修饰细胞的靶核酸的方法，所述方法包括：提供细胞，以及将配制用于以非病毒方式递送的组合物引入或提前引入到所述细胞中，所述组合物包含：(a)可靶向核酸酶蛋白；和(b)质粒供体模板，其包含：(i)同源定向修复(hdr)模板；(ii)第一共递送线性化(cdl)靶序列，其中第一cdl靶序列可操作地连接至hdr模板的5'；和(iii)第二cdl靶序列，其中第二cdl靶序列可操作地连接至hdr模板的3'，并且其中第一cdl靶序列和第二cdl靶序列各自能够被可靶向核酸酶蛋白或包含可靶向核酸酶蛋白的复合物切割。
4、本文还提供了一种用于修饰细胞的靶核酸的方法，所述方法包括：提供细胞，以及将配制用于以非病毒方式递送的组合物引入或提前引入到细胞中，所述组合物包含：(a)crispr-cas rna引导的核酸酶；(b)供体引导rna(grna)；和(c)质粒供体模板，其包含：(i)同源定向修复(hdr)模板；(ii)第一共递送线性化(cdl)靶序列，其中第一cdl靶序列可操作地连接至hdr模板的5'；和(iii)第二cdl靶序列，其中第二cdl靶序列可操作地连接至hdr模板的3'，并且其中(1)供体grna包含与第一cdl靶序列和第二cdl靶序列中的每一者互补的至少17个核苷酸，并且(2)第一cdl靶序列和第二cdl靶序列中的每一者可操作地连接至位于cdl靶序列3'的3碱基对原型间隔区相邻基序(pam)。
5、本文还提供了一种用于修饰细胞的基因组靶序列的方法，所述方法包括：提供细胞，以及将配制用于以非病毒方式递送的组合物引入或提前引入到所述细胞中，所述组合物包含：(a)crispr-cas rna引导的核酸酶；(b)供体引导rna(grna)；和(c)质粒供体模板，其包含：(i)同源定向修复(hdr)模板，其包含被同源臂侧接的用于插入的核酸；(ii)第一共递送线性化(cdl)靶序列，其中第一cdl靶序列可操作地连接至hdr模板的5'；和(iii)第二cdl靶序列，其中第二cdl靶序列可操作地连接至hdr模板的3'，并且其中(1)供体grna包含与第一cdl靶序列和第二cdl靶序列中的每一者互补的至少17个核苷酸，并且(2)第一cdl靶序列和第二cdl靶序列中的每一者可操作地连接至位于cdl靶序列3'的3碱基对原型间隔区相邻基序(pam)，其中供体grna包含与细胞的基因组靶序列互补的至少17个核苷酸，并且其中同源臂与侧接细胞的基因组靶序列的核酸序列互补，其中用于插入的核酸被构造为插入到细胞的基因组靶序列中。
6、在一些方面，可靶向核酸酶蛋白是rna引导的核酸酶。在一些方面，组合物还包含rna，所述rna包含与cdl靶序列互补的至少17个核苷酸。在一些方面，rna引导的核酸酶是cas蛋白。
7、在一些方面，所述组合物还包含被构造为形成包含可靶向核酸酶蛋白的复合物的供体引导rna(grna)，并且其中(1)供体grna包含与第一cdl靶序列和第二cdl靶序列中的每一者互补的至少17个核苷酸，并且(2)第一cdl靶序列和第二cdl靶序列中的每一者可操作地连接至位于cdl靶序列3'的3碱基对原型间隔区相邻基序(pam)。在一些方面，所述组合物还包含第一供体引导rna(grna)、第二供体grna，所述第一供体grna包含与第一cdl靶序列互补的至少17个核苷酸，所述第二供体grna包含与第二cdl靶序列互补的至少17个核苷酸，其中每个供体grna被构造为形成包含可靶向核酸酶蛋白的不同复合物，并且其中第一cdl靶序列和第二cdl靶序列中的每一者可操作地连接至位于cdl靶序列3'的3碱基对原型间隔区相邻基序(pam)。在一些方面，供体grna中的一者或多者包含与细胞的基因组靶序列互补的至少17个核苷酸。在一些方面，hdr模板包含与侧接细胞的基因组靶序列的核酸序列互补的同源臂。在一些方面，同源臂的长度各自独立地选自以下长度：至少400bp、至少500bp、至少600bp、至少700bp、至少800bp、至少900bp、1000bp、至少1100bp、至少1200bp、至少1300bp、1400bp、至少1500bp、至少160本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于修饰靶核酸的组合物，其包含：
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述可靶向核酸酶蛋白是RNA引导的核酸酶。
3.如权利要求0所述的组合物，其中所述组合物还包含RNA，所述RNA包含与所述CDL靶序列互补的至少17个核苷酸。
4.如权利要求0或0所述的组合物，其中所述RNA引导的核酸酶是Cas蛋白。
5.如权利要求0所述的组合物，其中所述组合物还包含被构造为形成包含所述可靶向核酸酶蛋白的所述复合物的供体引导RNA(gRNA)，并且其中(1)所述供体gRNA包含与所述第一CDL靶序列和所述第二CDL靶序列中的每一者互补的至少17个核苷酸，并且(2)所述第一CDL靶序列和所述第二CDL靶序列中的每一者可操作地连接至位于所述CDL靶序列3'的3碱基对原型间隔区相邻基序(PAM)。
6.如权利要求0所述的组合物，其中所述组合物还包含第一供体引导RNA(gRNA)、第二供体gRNA，所述第一供体gRNA包含与所述第一CDL靶序列互补的至少17个核苷酸，所述第二供体gRNA包含与所述第二CDL靶序列互补的至少17个核苷酸，
7.如权利要求0或0所述的组合物，其中所述供体gRNA中的一者或多者包含与所述细胞的基因组靶序列互补的至少17个核苷酸细胞。
8.如如权利要求0所述的组合物，其中所述HDR模板包含与侧接所述细胞的所述基因组靶序列的核酸序列互补的同源臂。
9.如权利要求0的组合物，其中所述同源臂的长度各自独立地选自以下长度：至少400bp、至少500bp、至少600bp、至少700bp、至少800bp、至少900bp、1000bp、至少1100bp、至少1200bp、至少1300bp、1400bp、至少1500bp、至少1600bp、至少1700bp、至少1800bp、至少1900bp或至少2000bp。
10.如权利要求1所述的组合物，其中：
11.一种用于修饰靶核酸的组合物，其包含：
12.如权利要求1至0中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含第二可靶向核酸酶蛋白，其中所述第二可靶向核酸酶蛋白或包含所述第二可靶向核酸酶蛋白的复合物能够切割所述细胞的基因组靶序列。
13.如权利要求0所述的组合物，其中所述第二可靶向核酸酶蛋白质是RNA引导的核酸酶。
14.如权利要求0所述的组合物，其中所述组合物还包含第二RNA，所述第二RNA包含与所述基因组靶序列互补的至少17个核苷酸。
15.如权利要求0或0所述的组合物，其中所述RNA引导的核酸酶是Cas蛋白。
16.如权利要求0所述的组合物，其中所述组合物还包含被构造为形成包含所述第二可靶向核酸酶蛋白的复合物的靶引导RNA(gRNA)，并且其中(1)所述靶gRNA包含与所述基因组靶序列互补的至少17个核苷酸，并且(2)所述基因组靶序列可操作地连接至位于所述基因组靶序列3'的3碱基对原型间隔区相邻基序(PAM)。
17.如权利要求0至0中任一项所述的组合物，其中所述第一CDL靶序列、所述第二CDL靶序列和所述基因组靶序列序列包含相同的核酸序列。
18.如权利要求0至0中任一项所述的组合物，其中所述基因组靶序列包含安全港核酸序列。
19.如权利要求0所述的组合物，其中所述安全港核酸序列包含核酸序列GAGCCATGCTTGGCTTACGA。
20.如权利要求0至0中任一项所述的组合物，其中所述PAM序列中的一个、两个在所述CDL靶序列和所述HDR模板之间编码或都不编码。
21.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述可靶向核酸酶和每种所述gRNA的摩尔比分别为1:10和2:1之间。
22.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述靶向核酸酶和所述供体模板的摩尔比分别为10:1至1000:1。
23.如权利要求1或0所述的组合物，其中所述可靶向核酸酶蛋白和/或所述第二可靶向核酸酶蛋白包含转录激活因子样(TAL)效应子DNA结合蛋白和核酸酶。
24.如权利要求1或0所述的组合物，其中所述可靶向核酸酶蛋白和/或第二可靶向核酸酶蛋白包含锌指DNA结合蛋白和核酸酶。
25.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述可靶向核酸酶蛋白和/或所述第二可靶向核酸酶蛋白与核定位信号(NLS)序列融合。...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种用于修饰靶核酸的组合物，其包含：
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述可靶向核酸酶蛋白是rna引导的核酸酶。
3.如权利要求0所述的组合物，其中所述组合物还包含rna，所述rna包含与所述cdl靶序列互补的至少17个核苷酸。
4.如权利要求0或0所述的组合物，其中所述rna引导的核酸酶是cas蛋白。
5.如权利要求0所述的组合物，其中所述组合物还包含被构造为形成包含所述可靶向核酸酶蛋白的所述复合物的供体引导rna(grna)，并且其中(1)所述供体grna包含与所述第一cdl靶序列和所述第二cdl靶序列中的每一者互补的至少17个核苷酸，并且(2)所述第一cdl靶序列和所述第二cdl靶序列中的每一者可操作地连接至位于所述cdl靶序列3'的3碱基对原型间隔区相邻基序(pam)。
6.如权利要求0所述的组合物，其中所述组合物还包含第一供体引导rna(grna)、第二供体grna，所述第一供体grna包含与所述第一cdl靶序列互补的至少17个核苷酸，所述第二供体grna包含与所述第二cdl靶序列互补的至少17个核苷酸，其中每个供体grna被构造成形成包含所述可靶向核酸酶蛋白的不同复合物，并且其中所述第一cdl靶序列和所述第二cdl靶序列中的每一者可操作地连接至位于所述cdl靶序列3'的3碱基对原型间隔区相邻基序(pam)。
7.如权利要求0或0所述的组合物，其中所述供体grna中的一者或多者包含与所述细胞的基因组靶序列互补的至少17个核苷酸细胞。
8.如如权利要求0所述的组合物，其中所述hdr模板包含与侧接所述细胞的所述基因组靶序列的核酸序列互补的同源臂。
9.如权利要求0的组合物，其中所述同源臂的长度各自独立地选自以下长度：至少400bp、至少500bp、至少600bp、至少700bp、至少800bp、至少900bp、1000bp、至少1100bp、至少1200bp、至少1300bp、1400bp、至少1500bp、至少1600bp、至少1700bp、至少1800bp、至少1900bp或至少2000bp。
10.如权利要求1所述的组合物，其中：
11.一种用于修饰靶核酸的组合物，其包含：
12.如权利要求1至0中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含第二可靶向核酸酶蛋白，其中所述第二可靶向核酸酶蛋白或包含所述第二可靶向核酸酶蛋白的复合物能够切割所述细胞的基因组靶序列。
13.如权利要求0所述的组合物，其中所述第二可靶向核酸酶蛋白质是rna引导的核酸酶。
14.如权利要求0所述的组合物，其中所述组合物还包含第二rna，所述第二rna包含与所述基因组靶序列互补的至少17个核苷酸。
15.如权利要求0或0所述的组合物，其中所述rna引导的核酸酶是cas蛋白。
16.如权利要求0所述的组合物，其中所述组合物还包含被构造为形成包含所述第二可靶向核酸酶蛋白的复合物的靶引导rna(grna)，并且其中(1)所述靶grna包含与所述基因组靶序列互补的至少17个核苷酸，并且(2)所述基因组靶序列可操作地连接至位于所述基因组靶序列3'的3碱基对原型间隔区相邻基序(pam)。
17.如权利要求0至0中任一项所述的组合物，其中所述第一cdl靶序列、所述第二cdl靶序列和所述基因组靶序列序列包含相同的核酸序列。
18.如权利要求0至0中任一项所述的组合物，其中所述基因组靶序列包含安全港核酸序列。
19.如权利要求0所述的组合物，其中所述安全港核酸序列包含核酸序列gagccatgcttggcttacga。
20.如权利要求0至0中任一项所述的组合物，其中所述pam序列中的一个、两个在所述cdl靶序列和所述hdr模板之间编码或都不编码。
21.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述可靶向核酸酶和每种所述grna的摩尔比分别为1:10和2:1之间。
22.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述靶向核酸酶和所述供体模板的摩尔比分别为10:1至1000:1。
23.如权利要求1或0所述的组合物，其中所述可靶向核酸酶蛋白和/或所述第二可靶向核酸酶蛋白包含转录激活因子样(tal)效应子dna结合蛋白和核酸酶。
24.如权利要求1或0所述的组合物，其中所述可靶向核酸酶蛋白和/或第二可靶向核酸酶蛋白包含锌指dna结合蛋白和核酸酶。
25....
【专利技术属性】
技术研发人员：A·库珀，PK·徐，R·莫特，A·特鲁昂，T·加德纳，B·徐，
申请(专利权)人：阿森纳生物科学公司，
类型：发明
国别省市：
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