【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物保种，具体涉及一种配套使用的大鼠胚胎冻存-复苏体系及其应用。
技术介绍
1、随着各种基因编辑技术的飞速发展，特别是在实验动物行业中出现了各种珍贵的基因修饰品系，保存这些品系的生物保种技术也被广泛应用，探寻更高效成功率的保种技术值得更深入的研究。冷冻技术主要包括慢速冷冻技术和玻璃化冷冻技术，慢速冷冻技术的低成活率限制了该方法在生物保种技术中的应用。
2、1985年，rall和fahy提出玻璃化冷冻技术之后，玻璃化冷冻技术已经被广泛应用于各种实验动物的胚胎冷冻中。玻璃化冷冻技术(vitrification)是指在室温将胚胎放置高浓度的冷冻保护剂中快速转入液氮中，而冷冻保护剂由液态形成一种类似玻璃的非结构状态，保持着正常的离子分布减少了对冻存胚胎的损伤。玻璃化冷冻技术中高浓度冷冻保护剂和快速的冷冻速度是两个关键步骤。浓度很高的冷冻保护剂具有一定的毒性，可能对胚胎造成一定的损伤，寻找毒性低的冷冻保护剂是提高冷冻效果的办法之一。冷冻胚胎最终放置-196℃的液氮中，温度跨度很大，低温损伤冰晶的形成都是在这个过程中造成的，一般形成于-5℃到-80℃。
3、大鼠可用于多种疾病模型的研究，结合目前基因修饰技术在科研上的广泛应用，对基因修饰大鼠的保种需求越来越多。但与小鼠不同的是，因大鼠精子的特殊性，无法通过精子冻存-复苏的方法获得具有较高活力的精子用于人工辅助生殖，商品化基因修饰大鼠的保种，尤其是纯合基因型的保种，更多的需要依赖于胚胎冻存-复苏的方法。但是，与小鼠的efs20/40或dap213法不同，目
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种配套使用的大鼠胚胎冻存-复苏体系及其应用。
2、本专利技术所采取的技术方案是：
3、第一个方面，本专利技术提供一种大鼠胚胎冻存预处理液，其组成为基础培养基，丙二醇95～110 ml/l、聚乙烯醇0.8～1.5g/l、抗生素适量。
4、在一些实例中，所述基础培养基的组分包括：钠离子、钾离子、钙离子、镁离子、氯离子、磷酸二氢根离子、硫酸根离子、碳酸氢根离子、丙酮酸根离子、乳酸根离子、葡萄糖。
5、在一些实例中，所述基础培养基的组成为：氯化钠95～105 mmol/l，氯化钾4～5mmol/l，氯化钙5～6 mmol/l，磷酸二氢钾0.3～0.5 mmol/l，硫酸镁 0.2～0.3 mmol/l，碳酸氢钠24～25 mmol/l，丙酮酸钠 0.3～0.4 mmol/l，乳酸钠17.5～19.0 mmol/l，葡萄糖2～3.5 mmol/l。
6、第二个方面，本专利技术提供一种大鼠胚胎冻存-复苏体系，所述冻存-复苏体系包括大鼠胚胎冻存预处理液、大鼠胚胎冻存保护液和大鼠胚胎复苏液，其中：
7、所述大鼠胚胎冻存预处理液如第一个方面所述；
8、所述大鼠胚胎冻存保护液的组成为：基础培养基，蔗糖、聚乙烯醇、丙二醇、乙二醇、percoll®培养基、抗生素；
9、所述大鼠胚胎复苏液的组成为：基础培养基、聚乙烯醇、蔗糖、抗生素。
10、在一些实例中，所述大鼠胚胎冻存保护液含有：蔗糖0.3～0.4 mol/l、丙二醇90～150 ml/l、聚乙烯醇0.8～1.5 g/l、乙二醇 250～400 ml/l、percoll®培养基120～250ml/l、抗生素适量。
11、在一些实例中，所述大鼠胚胎复苏液中含有：蔗糖0.3～0.4 mol/l、聚乙烯醇0.8～1.5 g/l，抗生素适量。
12、在一些实例中，所述基础培养基的组分包括：钠离子、钾离子、钙离子、镁离子、氯离子、磷酸二氢根离子、硫酸根离子、碳酸氢根离子、丙酮酸根离子、乳酸根离子、葡萄糖。
13、在一些实例中，所述基础培养基的组成为：氯化钠95～105 mmol/l，氯化钾4～5mmol/l，氯化钙5～6 mmol/l，磷酸二氢钾0.3～0.5 mmol/l，硫酸镁 0.2～0.3 mmol/l，碳酸氢钠24～25 mmol/l，丙酮酸钠 0.3～0.4 mmol/l，乳酸钠17.5～19.0 mmol/l，葡萄糖2～3.5 mmol/l。
14、在一些实例中，所述大鼠胚胎冻存预处理液的组成为：基础培养基，丙二醇95～110 ml/l、聚乙烯醇0.8～1.5 g/l、抗生素适量；
15、所述大鼠胚胎冻存保护液的组成为：基础培养基，蔗糖0.3～0.4 mol/l、丙二醇90～150 ml/l、聚乙烯醇0.8～1.5 g/l、乙二醇 250～400 ml/l、percoll®培养基120～250ml/l、抗生素适量；
16、所述大鼠胚胎复苏液的组成为：基础培养基，蔗糖0.3～0.4 mol/l、聚乙烯醇0.8～1.5 g/l，抗生素适量；
17、所述基础培养基的组成均为：氯化钠95～105 mmol/l，氯化钾4～5 mmol/l，氯化钙5～6 mmol/l，磷酸二氢钾0.3～0.5 mmol/l，硫酸镁 0.2～0.3 mmol/l，碳酸氢钠24～25mmol/l，丙酮酸钠 0.3～0.4 mmol/l，乳酸钠17.5～19.0 mmol/l，葡萄糖2～3.5 mmol/l。
18、第三个方面，本专利技术第二个方面所述的冻存-复苏体系在保存大鼠胚胎中的应用。
19、本专利技术的有益效果是：
20、由于大鼠在多种疾病模型中的重要作用，本专利技术突破大鼠种质资源保存的瓶颈，配套使用的大鼠胚胎冻存-复苏体系的应用可以使得大鼠胚胎的冻存-复苏，及随后的人工辅助生殖得以顺利进行，尤其是针对纯合基因型的大鼠资源，将自然繁殖所需的数月时间大大减少为一个月内即可获得spf级的后代，可快速获得特定基因型或基因修饰后的大鼠资源。
21、另外本专利技术配套使用的大鼠胚胎冻存-复苏体系使得高存活效率的大鼠胚胎冻存-复苏技术得以实现，继而使得大鼠种质超低温冷冻保存后的人工辅助生殖能够顺利进行，为大鼠种质资源保存提供保障。
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1.一种大鼠胚胎冻存预处理液，其组成为基础培养基，丙二醇95～110 mL/L、聚乙烯醇0.8～1.5 g/L、抗生素适量。
2.根据权利要求1所述的大鼠胚胎冻存预处理液，其特征在于，所述基础培养基的组分包括：钠离子、钾离子、钙离子、镁离子、氯离子、磷酸二氢根离子、硫酸根离子、碳酸氢根离子、丙酮酸根离子、乳酸根离子、葡萄糖。
3.根据权利要求2所述的大鼠胚胎冻存预处理液，其特征在于，所述基础培养基的组成为：氯化钠95～105 mmol/L，氯化钾4～5 mmol/L，氯化钙5～6 mmol/L，磷酸二氢钾0.3～0.5 mmol/L，硫酸镁 0.2～0.3 mmol/L，碳酸氢钠24～25 mmol/L，丙酮酸钠 0.3～0.4mmol/L，乳酸钠17.5～19.0 mmol/L，葡萄糖2～3.5 mmol/L。
4.一种大鼠胚胎冻存-复苏体系，其特征在于，所述冻存-复苏体系包括大鼠胚胎冻存预处理液、大鼠胚胎冻存保护液和大鼠胚胎复苏液，其中：
5.根据权利要求4所述的冻存-复苏体系，其特征在于，所述大鼠胚胎冻存保护液含有：蔗糖0.3
6.根据权利要求4所述的冻存-复苏体系，其特征在于，所述大鼠胚胎复苏液中含有：蔗糖0.3～0.4 mol/L、聚乙烯醇0.8～1.5 g/L，抗生素适量。
7.根据权利要求4～6任一项所述的冻存-复苏体系，其特征在于，所述基础培养基的组分包括：钠离子、钾离子、钙离子、镁离子、氯离子、磷酸二氢根离子、硫酸根离子、碳酸氢根离子、丙酮酸根离子、乳酸根离子、葡萄糖。
8.根据权利要求7所述的冻存-复苏体系，其特征在于，所述基础培养基的组成为：氯化钠95～105 mmol/L，氯化钾4～5 mmol/L，氯化钙5～6 mmol/L，磷酸二氢钾0.3～0.5 mmol/L，硫酸镁 0.2～0.3 mmol/L，碳酸氢钠24～25 mmol/L，丙酮酸钠 0.3～0.4 mmol/L，乳酸钠17.5～19.0 mmol/L，葡萄糖2～3.5 mmol/L。
9.根据权利要求7所述的冻存-复苏体系，其特征在于，所述大鼠胚胎冻存预处理液的组成为：基础培养基，丙二醇95～110 mL/L、聚乙烯醇0.8～1.5 g/L、抗生素适量；
10.权利要求4～9任一项所述的冻存-复苏体系在保存大鼠胚胎中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种大鼠胚胎冻存预处理液，其组成为基础培养基，丙二醇95～110 ml/l、聚乙烯醇0.8～1.5 g/l、抗生素适量。
2.根据权利要求1所述的大鼠胚胎冻存预处理液，其特征在于，所述基础培养基的组分包括：钠离子、钾离子、钙离子、镁离子、氯离子、磷酸二氢根离子、硫酸根离子、碳酸氢根离子、丙酮酸根离子、乳酸根离子、葡萄糖。
3.根据权利要求2所述的大鼠胚胎冻存预处理液，其特征在于，所述基础培养基的组成为：氯化钠95～105 mmol/l，氯化钾4～5 mmol/l，氯化钙5～6 mmol/l，磷酸二氢钾0.3～0.5 mmol/l，硫酸镁 0.2～0.3 mmol/l，碳酸氢钠24～25 mmol/l，丙酮酸钠 0.3～0.4mmol/l，乳酸钠17.5～19.0 mmol/l，葡萄糖2～3.5 mmol/l。
4.一种大鼠胚胎冻存-复苏体系，其特征在于，所述冻存-复苏体系包括大鼠胚胎冻存预处理液、大鼠胚胎冻存保护液和大鼠胚胎复苏液，其中：
5.根据权利要求4所述的冻存-复苏体系，其特征在于，所述大鼠胚胎冻存保护液含有：蔗糖0.3～0.4 mol/l、丙二醇90～150 ml/l、聚乙烯醇0.8～1.5 g/l、乙二醇 250～400ml/l、per...
【专利技术属性】
技术研发人员：林祁远，苏翠，黎肖容，
申请(专利权)人：广州赛业百沐生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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