【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于药物筛选，尤其涉及一种筛选人冠状病毒主要蛋白酶3clpro抑制剂的方法。
技术介绍
1、冠状病毒是一种单股正链rna病毒。虽然研发出多种冠状病毒的疫苗，但是由于其基因组的特异性，导致疫苗保护容易失效，因此抗病毒疗法对于降低感染者的发病率和死亡率非常重要。
2、目前针对冠状病毒药物筛选的方法主要有针对单一病毒蛋白的计算机辅助药物设计或使用野生型冠状病毒对一些已批准的抗病毒药物进行小规模药物筛选。这两种方法虽然取得了积极的结果，但也存在明显的局限性。计算机辅助药物设计只能针对单个或多个病毒靶点进行药物筛选，而不能模拟整个病毒生命周期，这可能会损失大量潜在的抗病毒药物，并且还需要进行药理实验来评估候选药物的实际抗病毒活性。考虑到野生型冠状病毒的生物安全性要求，活病毒药物筛选方法通常用于根据临床经验从现有的几种抗病毒药物中识别有效的治疗药物，因此，该方法不适用于高通量药物筛选。
3、冠状病毒主要蛋白酶3clpro是冠状病毒关键的蛋白水解酶之一，可以特异性识别并切割非结构蛋白中的lq↓s(↓表示切割位点)，释放主要负责病毒基因组的复制、转录以及参与病毒蛋白质翻译、修饰和核酸合成的蛋白，因此抑制3clpro蛋白酶的活性可以有效的抑制病毒的复制和转录。此外3clpro在人类细胞中没有发现同源物，且在人冠状病毒基因组基因序列高度保守，是一个理想的抗冠状病毒靶点。
4、绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，gfp)分子量约为27kda，是一个由238个氨基酸组成的单链多
技术实现思路
1、本专利技术提供了一种人冠状病毒主要蛋白酶3clpro的活性报告质粒，通过在gfp的β链中插入人冠状病毒主要蛋白酶3clpro的切割位点lq↓sg或rlq↓sgf(↓表示切割位点)，构建了gfp的两种突变体，为质粒pcmv-gfp-β8-lqsg-9-lqsg-10或质粒pcmv-gfp-β9-rlqsgf-10，质粒pcmv-gfp-β8-lqsg-9-lqsg-10核苷酸序列如seq id no:1所示，质粒pcmv-gfp-β9-rlqsgf-10核苷酸序列如seq id no:2所示；
2、质粒pcmv-gfp-β8-lqsg-9-lqsg-10是为在gfp的β链8、9、10之间插入lq↓sg，该突变体转染293t细胞后，较野生型来说荧光强度减弱，当被冠状病毒主要蛋白酶3clpro切割后，荧光强度明显变弱。质粒pcmv-gfp-β9-rlqsgf-10是在gfp的β链9和10之间插入rlq↓sgf，该突变体转染293t细胞，较野生型来说荧光强度差异不明显，当被冠状病毒主要蛋白酶3clpro切割后，其荧光强度大幅减弱。因此，两种gfp突变体的绿色荧光强度可以指示冠状病毒主要蛋白酶3clpro的活性，即绿色荧光强度与3clpro的活性成反比。
3、本专利技术另一目的是将上述人冠状病毒主要蛋白酶3clpro的报告质粒应用在筛选抗人冠状病毒药物中。
4、本专利技术通过以下技术方案实现本专利技术目的：
5、1、人冠状病毒主要蛋白酶3clpro的报告质粒的构建
6、质粒pcmv-gfp-β8-lqsg-9-lqsg-10构建方法如下：
7、(1)以pegfp-n3质粒(市购)为模版，采用引物gfp-f：cgggaattcatggtgagcaagggcgaggagc；gfp-r：ccgctcgagcttgtacagctcgtccatgccgagagtg进行扩增获得gfp基因(在gfp基因5’端和3’端分别引入ecorⅰ和xhoⅰ)，通过ecorⅰ和xhoⅰ双酶切，将gfp基因连接到pcmv-c-flag质粒上获得pcmv-gfp-c-flag质粒；
8、(2)以pcmv-gfp-c-flag质粒为模板，采用质粒突变引物gfpβ8-9-lqs-f：cacaacatcgaggacctgcagagcggcagcgtgcagctcgccgaccactac、gfpβ8-9-lqs-r：cgctgccgctctgcaggtcctcgatgttgtggcggatcttgaagttcaccttgatgccgttc；
9、gfpβ9-10-f：catcggcgacctgcagagcggccccgtgctgctgcccgacaaccactac、gfpβ9-10-r：cacggggccgctctgcaggtcgccgatgggggtgttctgctggtag进行扩增，扩增产物使用dpnⅰ酶处理，去除未产生突变的质粒，利用琼脂糖凝胶dna回收试剂盒回收dpnⅰ酶处理后的质粒dna；
10、本步骤使用的质粒突变引物是含有3clpro切割位点lq↓sg(↓表示切割位点)的点突变引物，扩增后实现将lq↓sg插入到gfp基因β链8、9、10之间的目的；
11、(3)使用dpnⅰ酶处理后的质粒转化至感受态细胞，挑取单克隆，提取质粒并进行测序验证质粒构建成功后，使用无内毒素质粒提取试剂盒提取获得质粒pcmv-gfp-β8-lqsg-9-lqsg-10。
12、质粒pcmv-gfp-β9-rlqsgf-10构建方法同质粒pcmv-gfp-β8-lqsg-9-lqsg-10构建，不同在于步骤(2)中采用的质粒突变引物为gfp9-10-rlqsgf-f：catcggcgacaggctgcagagcggcttccccgtgctgctgcccgacaaccactac、gfp9-10-rlqsgf-r：gccgctctgcagcctgtcgccgatgggggtgttctg；使用的质粒突变引物是含有3clpro切割位点rlq↓sgf(↓表示切割位点)的点突变引物，扩增后实现将rlq↓sgf插入到gfp基因β链9和10之间的目的。
13、2、采用上述构建的被人冠状病毒主要蛋白酶3clpro切割后绿色荧光强度降低的pcmv-gfp-β8-lqsg-9-lqsg-10报告质粒或pcmv-gfp-β9-rlqsgf-10报告质粒筛选抗人冠状病毒药物，方法如下：
14、(1)使用吸附浓度为100tcid50的人冠状病毒(hcov-oc43)培养液感染293t细胞(人肾上皮细胞)，感染病毒的细胞分2组培养，一组添加待筛药物为实验组，不添加带筛选药物的为对照组；
15、(2)使用pcmv-gfp-β8-lqsg-9-lqsg-10报告质粒或pcmv-gfp-β9-rlqsgf-10报告质粒转染步骤(1)中实验组、对照组的293t细胞；
16、(3)转染后，使用激光共聚焦检显微镜测绿色荧光的强度，若实验组的绿色荧光强度高于对照组，那么该待筛药物判定为3clpro的抑制剂。本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种人冠状病毒主要蛋白酶3CLpro的活性报告质粒，其特征在于：为质粒pCMV-GFP-β8-LQSG-9-LQSG-10或质粒pCMV-GFP-β9-RLQSGF-10，质粒pCMV-GFP-β8-LQSG-9-LQSG-10核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，质粒pCMV-GFP-β9-RLQSGF-10核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.权利要求1所述的人冠状病毒主要蛋白酶3CLpro的活性报告质粒在筛选抗人冠状病毒药物中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种人冠状病毒主要蛋白酶3clpro的活性报告质粒，其特征在于：为质粒pcmv-gfp-β8-lqsg-9-lqsg-10或质粒pcmv-gfp-β9-rlqsgf-10，质粒pcmv-gfp-β8-lqsg-9-lqsg-10核苷...
【专利技术属性】
技术研发人员：张阿梅，施秋梅，夏雪山，董书维，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：
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