【技术实现步骤摘要】
本申请属于生物工程，具体涉及一种原生质体的制备方法和原生质体的转化方法及其应用。
技术介绍
1、植物的原生质体是没有细胞壁的单细胞，通过peg介导的瞬时转化技术可以将外源质粒直接导入原生质体中进行快速的瞬时表达，因此植物原生质体可以用于研究蛋白的亚细胞定位、大分子互作、信号转导以及基因编辑等。鉴于植物原生质体在功能基因研究中的优势，目前许多物种都建立了基于peg的原生质体转化技术。但值得一提的是，不同植物以及不同植物组织部位的原生质体制备和转化操作方法都不尽相同。因此原生质体制备和转化方法往往需要进一步优化才能达到简单高效。
2、目前棉花中已经报道了基于真叶、子叶、愈伤和根的原生质体纯化和转化技术。其中真叶和根的转化效率较高，超过了90%，愈伤的转化效率在35%-45%之间。但这些技术存在材料生长周期长、预处理和后续实验步骤繁琐等问题。比如愈伤组织和真叶需要较长的材料培养时间（五片真叶），而根部材料的预处理较为麻烦，比如从土壤中分离容易损伤根部或水培需要沥干水分。子叶材料的生长时间虽然较短，但棉花种壳往往限制子叶充分展开，增加预处理操作难度。棉花的下胚轴可以用于原生质体的分离，如专利申请cn202110469528中所示，但该方法仍需要培养无菌苗、预处理等，上述操作与愈伤组织相似需要无菌条件，使操作步骤变的繁琐且容易失败。目前棉花中未见下胚轴相关的其他转化方法。事实上不仅是以上提到的原生质体制备和转化技术，许多物种的原生质体制备和转化技术都存在材料生长时间久、材料预处理麻烦、纯化时间长等问题。但其优化主要是针对酶解阶
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术提供了一种原生质体的制备方法和原生质体的转化方法及其应用。该方法能够快速便捷的制备原生质体并进行高效的转化，来降低原生质体技术的使用门槛。
2、为了达到上述目的，本专利技术提出了了以下技术方案：
3、本专利技术提供了一种原生质体的制备方法，所述处理方法包括以下步骤：栽培得到幼苗，对幼苗进行预处理得到预处理样品，使用酶解液酶解预处理样品得到酶解细胞，纯化酶解细胞得到原生质体。
4、本专利技术通过上述制备方法制备获得的原生质体具有产出比大、活力高的优势，同时对外源基因的转化成功率高，有重要的应用前景。
5、在本专利技术中，所述栽培包括以下步骤：取植物种子进行催芽处理，处理结束后栽培于培养土中，培养5~14天，所述培养的温度为28℃，培养的条件为避光。
6、本专利技术优选的，取健康棉花种子；使用无菌水清洗表层杂质；在量杯中加入10倍棉花体积的无菌水进行浸泡催芽，所述催芽培养的培养条件为24～28℃，浸泡时长>24h；取开口发芽的种子种入提前拌好的湿润的培养土中，置于培养箱避光培养，所述培养的培养条件为28℃；培养时间在5~14天范围内的健康的下胚轴即可作为原始材料使用。
7、本专利技术提出使用暗培养5~14天范围内的健康的下胚轴，无需清洗等额外的预处理操作，可以更快速获得大量原始材料。
8、在本专利技术中，所述预处理包括以下步骤：获取幼苗的下胚轴，将下胚轴斜切成段；所述下胚轴切段的宽度为0.5~1.0 mm。
9、本专利技术优选的，根据苗的大小，取适量培养的棉花幼苗，置于无菌过滤吸水纸上，切除胚根和子叶，对伸长的下胚轴使用刀片斜切成均匀的切段，并转移至无菌培养皿中。
10、在本专利技术中，所述酶解液与解预处理样品的体积重量比为5ml：1g。
11、在本专利技术中，所述酶解的条件为黑暗，酶解的温度为室温，酶解的时间为3h；所述酶解过程包括以下步骤；将酶解液浸没预处理样品，于室温黑暗的环境下酶解3h。
12、本专利技术优选的，按特定浓度和配比称取酶解液的各试剂加入到无菌管，混合后置于55℃水浴锅加热并冷却至室温使用，加热期间进行多次上下震荡混匀操作；使用配套的注射器和0.45μm纤维素微孔滤膜过滤器缓慢地对冷却至室温的酶解液进行过滤，滤液置于干净的无菌培养皿中，同时将对应配比的经过预处理的下胚轴切段（预处理样品）加入培养皿中并轻轻摇晃，使酶解液完全浸没所有下胚轴切段；将上述培养皿用锡纸完全覆盖，于24～28℃室温环境下在水平摇床上以50rpm速度轻摇，根据下胚轴使用量酶解处理3h；酶解完成后，所取材料释放出原生质体细胞到溶液中后，溶液呈现出明显的黄色。
13、在本专利技术中，所述纯化包括以下步骤；
14、将酶解细胞与w5溶液混合后依次进行过滤和离心处理得到沉淀，将沉淀与w5溶液混合得到纯化的原生质体细胞液；所述酶解细胞与w5溶液的体积比为1：1；所述离心的温度为4℃，离心的转速为720 rpm，离心的时间为2 min，离心的升降速均为1。
15、本专利技术优选的，酶解结束后对处理得到酶解细胞液加入刚从4℃环境取出的w5溶液以终止酶解反应，轻摇混匀后对原生质体混合液进行过滤，以去除残留的细胞碎片和其他杂质，所述过滤器为40μm细胞过滤器；将过滤后的原生质体混合液水平缓慢加入至无菌离心管，于离心机温度4℃、升速为1、降速为1的条件下离心，以沉淀原生质体并分离出w5和酶解混合上清液；离心完成后缓慢取出离心管，小心地吸弃上清，收集到纯净的原生质体细胞沉淀；再次加入w5溶液并轻摇混匀得到纯化的原生质体细胞液。
16、本专利技术还提供了一种原生质体的转化方法，所述转化方法包括以下步骤；
17、离心纯化的原生质体细胞液取沉淀（即原生质体），使用mmg溶液重悬沉淀得到原生质体mmg悬浮液，将质粒加入原生质体mmg悬浮液中，混匀后避光静置10min得到原生质体质粒混合液；静置结束后向原生质体质粒混合液加入peg溶液室温避光孵育20~30min，孵育结束后加入w5溶液并进行离心处理得到沉淀，向沉淀中加入w5溶液避光静置过夜，完成原生质体的转化。
18、经过实验比较，发现两次离心最佳的条件分别为4℃，720 rpm，2 min，升降速均为1和4℃，400 g，5 min，升降速均为1。离心完成后缓慢取出离心管，注意小心地吸弃上清。
19、用mmg溶液重悬原生质体时，所述最终重悬的原生质体密度为1～2×105/ml。
20、所述原生质体由上述任一项制备方法制备得到的。
21、本专利技术优选的，将mmg溶液与原生质体混合得到原生质体mmg悬浮液，将原生质体mmg悬浮液分装取样，加入相应配比的待转化的质粒载体，轻摇混匀，置于温度为24～28℃条件下避光静置；所述原生质体mmg悬浮液和载体的配比为原生质体mmg悬浮液：载体≈10:1；所述避光静置时长为10min；对静置后的原生质体和质粒混合液，水平加入一定量配比的新鲜配制的peg溶液并缓慢地将其移至管底，轻摇混匀，避光环境下孵育；所述peg溶液和原生质体质粒混合液的配比为peg溶液：原生质体质粒混合液=1:1；将上述避光静置的原生质体pe本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种原生质体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：栽培得到幼苗，对幼苗进行预处理得到预处理样品，使用酶解液酶解预处理样品得到酶解细胞，纯化酶解细胞得到原生质体；
2.一种原生质体的转化方法，其特征在于，所述转化方法包括以下步骤；
3.权利要求1所述的制备方法和2所述的转化方法在简化原生质体转化流程中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用包括蛋白的亚细胞定位、大分子互作、信号转导和基因编辑。
【技术特征摘要】
1.一种原生质体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：栽培得到幼苗，对幼苗进行预处理得到预处理样品，使用酶解液酶解预处理样品得到酶解细胞，纯化酶解细胞得到原生质体；
2.一种原生质体的转化方法，其特征在于，所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：宋国立，郝云飞，李媛媛，袁张程，左东云，王志成，
申请(专利权)人：三亚中国农业科学院国家南繁研究院，
类型：发明
国别省市：
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