【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物分析，具体涉及一种基于磁性微球分离的单细胞多组学分析方法及其应用，用于单细胞中转录和蛋白质多组学的非靶向联合分析。
技术介绍
1、作为生命的基本组成单元，细胞具有巨大的异质性，并普遍存在于各种组织及细胞系统中。近年来，单细胞组学分析技术的快速发展为揭示复杂细胞系统中细胞异质性、微环境影响和罕见细胞类型的独特特征提供了重要的见解。然而，单一组学的数据只能提供不完整的信息。如今，随着单细胞rna测序(single-cellrnasequencing,scrna-seq)技术的开发和应用，成功实现与基因组和表观基因组测序技术的结合和细胞表型的深入研究。相比之下，蛋白质作为细胞功能的直接执行者，在细胞表型分析中起着至关重要的作用。然而，mrna和其同源蛋白是非线性相关的，难以从转录组数据中直接推断蛋白水平的表达。整合单细胞中转录组和蛋白质组的测量可以增强探索mrna和蛋白质丰度之间关系的分析，多组学数据之间相互验证，增强对不同细胞类型/状态和功能的更稳健的定义。然而由于蛋白质的低丰度和不可扩增的特性，以及两组学分析操作之间的协作困难，在单细胞水平上同时分析转录组和蛋白质组仍然面临巨大挑战。
2、单细胞蛋白质组学(single-cellproteomics,scp)分析的现有技术多采用特异性抗体标记相应蛋白的靶向策略，并开发了几种基于抗体的蛋白质分析与scrna-seq技术相结合的单细胞多组学方法。但整体受限于抗体的可用性和特异性，大多数这些技术在单个细胞中只能检测到数十种已知的靶向蛋白质。此外，理想的单细胞
技术实现思路
1、解决的技术问题：针对现有技术中不能从同一个细胞个体中获得多组学信息的技术问题，本专利技术提供一种基于磁性微球分离的单细胞多组学分析方法及其应用，可以有效收集同一单细胞中的mrna和蛋白质组分，以便后续的下游多组学分析，将scrna-seq技术与基于shotgun策略的质谱技术相结合，实现单细胞内转录-蛋白质多组学的非靶向和深度分析方法。
2、技术方案：一种基于磁性微球分离的单细胞多组学分析方法，步骤如下：
3、(1)用裂解液和冻融循环对分选到反应管内的单细胞裂解得到细胞裂解物，并构建磁性微球，将磁性微球加进细胞裂解物中，捕获游离的mrna，待充分捕获完成后，通过磁性富集将含有蛋白质的上清液转移至新的反应管中，实现对裂解释放的mrna和蛋白质进行收集和分离，其中，所述磁性微球由羧基修饰的四氧化三铁磁珠表面及编码标签引物功能化组装合成，组装合成后的磁性微球表面用牛血清白蛋白进行位点封闭，阻断非特异性吸附；
4、(2)对收集的mrna进行逆转录、预扩增、cdna纯化、tn5转座酶打断、文库构建pcr、文库纯化以形成转录组文库并进行测序；对分离出的蛋白质进行变性、还原、烷基化、酶解消化以形成肽段并进行色谱分离与质谱鉴定。
5、作为优选，所述由羧基修饰的四氧化三铁磁珠表面及编码标签引物功能化组装合成方法如下：磁性微球大小为10～50μm，在5μl的2.5mg/ml磁珠中加入5μl的2.5mg/ml edc与10～30μl的10μm编码标签引物进行装配，在涡旋震荡仪上孵育4～7个小时，涡旋速度为1500rpm，孵育温度为28℃。
6、作为优选，所述组装合成后的磁性微球表面用牛血清白蛋白进行位点封闭方法如下：组装后的磁性微球样品置于磁力架5min，移除上清；然后将样品从磁力架上取出，加入5μltrisbuffer重悬微球；通过加入5μl的2％(w/v)牛血清白蛋白(bsa)溶液进行位点封闭，在涡旋震荡仪上孵育2～12个小时，涡旋速度为500～800rpm，孵育温度为10～20℃，封闭之后，将磁性微球样品置于磁力架5min，移除上清，然后将样品从磁力架上取出，加入pbs溶液清洗，重复两次，最后用10μltris buffer重悬微球待用。
7、作为优选，所述编码标签引物由测序通用序列、barcode标签、独特分子标签umi、poly-t四种部分组合构成，编码标签引物的5’端进行氨基修饰，barcode标签由8个已知碱基组成，umi由8个随机碱基n设计合成，poly-t由8～31个t碱基组成。
8、作为优选，所述步骤(1)中裂解液由浓度为0.1％(w/v)十二烷基-β-d-麦芽糖苷(ddm)，10mm tris，5mm三(2-羧乙基)膦(tcep)和1x rnase inhibitor组成，加入待测的单细胞之前，预先在反应管中加入3μl所述的裂解液；冻融循环的条件为在-80℃下速冻10～15min，然后在37℃下加热10～40min进行细胞裂解；分选为流式细胞分选仪的单细胞分选；反应管为200μl容量的pcr管或96孔微孔板，所述反应管预先用0.1％ddm加满浸泡10～15小时，然后倒出溶液，并在通风橱风干待用(主要目的为减少单细胞中蛋白质吸附损失)。
9、作为优选，所述步骤(1)中，对裂解释放的mrna和蛋白质进行收集和分离具体为：加入1μl的磁性微球至反应管中，在pcr恒温仪上70～75℃加热3min，取出置于冰上5min，然后在35～45℃震荡反应10～20min捕获mrna，然后将反应管置于磁力架3～5min，转移含有蛋白质的上清液实现分离。
10、作为优选，所述步骤(2)中，对收集的mrna进行逆转录、预扩增、cdna纯化、tn5转座酶打断、文库构建pcr、文库纯化以形成转录组文库并进行测序，其中：
11、所述逆转录反应程序设置：42℃，90min；10～14个循环数(50℃，2min和42℃，2min)；70～72℃，15min；4℃，∞；
12、所述预扩增反应程序设置：98℃，3min；25～28个循环(98℃，20s；61℃，15s；72℃，6min)；72℃5min；4℃，∞；
13、所述文库构建pcr扩增反应程序设置：72℃，3min；2～13个循环(95℃，10s；55℃，30s；72℃，30s)；14个循环(72℃5min)；4℃，∞。
14、作为优选，所述对分离出的蛋白质进行变性、还原、烷基化、酶解消化以形成肽段并进行色谱分离与质谱鉴定，其中：
15、所述变性和还原反应为pcr恒温仪上70～80℃下恒温孵育30～60min进行，随后离心2～5min处理；
16、所述烷基化反应为通过加入0.5～1μl的70～100mm碘乙酰胺(iaa)溶液，并在室温下黑暗孵育30min进行；
17、所述酶解消化反应为通过加入0.5μl(酶：蛋白质(w/w)为1：5)的重组赖氨酰内切酶溶液和1μl(酶：蛋白质(w/w本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于磁性微球分离的单细胞多组学分析方法，其特征在于，步骤如下：
2.根据权利要求1所述的一种基于磁性微球分离的单细胞多组学分析方法，其特征在于，所述由羧基修饰的四氧化三铁磁珠表面及编码标签引物功能化组装合成方法如下：磁性微球大小为10～50μm，在5μL的2.5mg/mL磁珠中加入5μL的2.5mg/mL EDC与10～30μL的10μM编码标签引物进行装配，在涡旋震荡仪上孵育4～7个小时，涡旋速度为1500rpm，孵育温度为28℃。
3.根据权利要求2所述的一种基于磁性微球分离的单细胞多组学分析方法，其特征在于，所述组装合成后的磁性微球表面用牛血清白蛋白进行位点封闭方法如下：组装后的磁性微球样品置于磁力架5min，移除上清；然后将样品从磁力架上取出，加入5μL TrisBuffer重悬微球；通过加入5μL的2％w/v牛血清白蛋白溶液进行位点封闭，在涡旋震荡仪上孵育2～12个小时，涡旋速度为500～800rpm，孵育温度为10～20℃，封闭之后，将磁性微球样品置于磁力架5min，移除上清，然后将样品从磁力架上取出，加入PBS溶液清洗，重复两次，最后
4.根据权利要求1所述的一种基于磁性微球分离的单细胞多组学分析方法，其特征在于，所述编码标签引物由测序通用序列、barcode标签、独特分子标签UMI、Poly-T四种部分组合构成，编码标签引物的5’端进行氨基修饰，barcode标签由8个已知碱基组成，UMI由8个随机碱基N设计合成，Poly-T由8～31个T碱基组成。
5.根据权利要求1所述的一种基于磁性微球分离的单细胞多组学分析方法，其特征在于，所述步骤(1)中裂解液由3μL浓度为0.1％DDM，10mM Tris，5mM三(2-羧乙基)膦和1xRNase inhibitor组成；冻融循环的条件为在-80℃下速冻10～15min，然后在37℃下加热10～40min进行细胞裂解；分选为流式细胞分选仪的单细胞分选；反应管为200μL容量的PCR管或96孔微孔板，所述反应管预先用0.1％十二烷基-β-D-麦芽糖苷加满浸泡10～15小时，然后倒出溶液，并在通风橱风干待用。
6.根据权利要求1所述的一种基于磁性微球分离的单细胞多组学分析方法，其特征在于，所述步骤(1)中，对裂解释放的mRNA和蛋白质进行收集和分离具体为：加入1μL的磁性微球至反应管中，在PCR恒温仪上70～75℃加热3min，取出置于冰上5min，然后在35～45℃震荡反应10～20min捕获mRNA，然后将反应管置于磁力架3～5min，转移含有蛋白质的上清液实现分离。
7.根据权利要求1所述的一种基于磁性微球分离的单细胞多组学分析方法，其特征在于，所述步骤(2)中，对收集的mRNA进行逆转录、预扩增、cDNA纯化、Tn5转座酶打断、文库构建PCR、文库纯化以形成转录组文库并进行测序，其中：
8.根据权利要求1所述的一种基于磁性微球分离的单细胞多组学分析方法，其特征在于，所述对分离出的蛋白质进行变性、还原、烷基化、酶解消化以形成肽段并进行色谱分离与质谱鉴定，其中：
9.根据权利要求8所述的一种基于磁性微球分离的单细胞多组学分析方法，其特征在于，所述质谱中采用设置分离电荷为2至7的前体离子，分离窗口为4，AGC靶标为1E5，离子最大注入时间设为300ms。
10.权利要求1所述的一种基于磁性微球分离的单细胞多组学分析方法在同一单细胞的转录组和蛋白质组的多组学分析和鉴定中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种基于磁性微球分离的单细胞多组学分析方法，其特征在于，步骤如下：
2.根据权利要求1所述的一种基于磁性微球分离的单细胞多组学分析方法，其特征在于，所述由羧基修饰的四氧化三铁磁珠表面及编码标签引物功能化组装合成方法如下：磁性微球大小为10～50μm，在5μl的2.5mg/ml磁珠中加入5μl的2.5mg/ml edc与10～30μl的10μm编码标签引物进行装配，在涡旋震荡仪上孵育4～7个小时，涡旋速度为1500rpm，孵育温度为28℃。
3.根据权利要求2所述的一种基于磁性微球分离的单细胞多组学分析方法，其特征在于，所述组装合成后的磁性微球表面用牛血清白蛋白进行位点封闭方法如下：组装后的磁性微球样品置于磁力架5min，移除上清；然后将样品从磁力架上取出，加入5μl trisbuffer重悬微球；通过加入5μl的2％w/v牛血清白蛋白溶液进行位点封闭，在涡旋震荡仪上孵育2～12个小时，涡旋速度为500～800rpm，孵育温度为10～20℃，封闭之后，将磁性微球样品置于磁力架5min，移除上清，然后将样品从磁力架上取出，加入pbs溶液清洗，重复两次，最后用10μl tris buffer重悬微球待用。
4.根据权利要求1所述的一种基于磁性微球分离的单细胞多组学分析方法，其特征在于，所述编码标签引物由测序通用序列、barcode标签、独特分子标签umi、poly-t四种部分组合构成，编码标签引物的5’端进行氨基修饰，barcode标签由8个已知碱基组成，umi由8个随机碱基n设计合成，poly-t由8～31个t碱基组成。
5.根据权利要求1所述的一种基于磁性微球分离的单细胞多组学分析方法，其特征在于，所述步骤(1)中裂解液由3μl浓度为0.1％ddm，...
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