【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，特别是一种同时检测多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌的检测体系和方法。
技术介绍
1、多杀性巴氏杆菌(pasteurellamultocida)属于巴氏杆菌科巴氏杆菌属的细菌，巴氏杆菌属细菌已报道有20多种，多杀性巴氏杆菌是本属中最重要的畜禽致病菌。本菌可引起多种畜禽巴氏杆菌病，表现为出血性败血病或传染性肺炎。本菌广泛分布于世界各地，正常存在于多种健康动物的口腔和咽部黏膜，属于条件致病菌。多杀性巴氏杆菌可感染人类和多种动物，引起各种畜禽传染病，如禽霍乱、猪肺疫、牛出血性败血症、兔出血性败血症等，对养殖业造成严重危害。根据carter分型方法和heddleston分型方法，分别依据荚膜抗原的不同和脂多糖抗原的不同将多杀性巴氏杆菌分为5种荚膜血清型(a、b、d、e、f)和16种菌体血清型(1-16)，由于多杀性巴氏杆菌血清型复杂，各型之间交叉保护性不强，导致疫苗防控难度较大，只有通过病原监测，结合卫生消毒与生物安全等可有效预防本病的发生与流行。
2、溶血性曼氏杆菌是mannheimia属的微生物，是引起牛羊等反刍动物呼吸疾病综合征(bovine respiratory disease complex,brd)的病原之一，当运输、环境等应激或其他病原协同感染导致宿主抵抗力下降时，病原侵袭肺部引起疾病发生，对牛场养殖造成巨大的损失。尽管较多血清型菌株均能引起发病，但从全球感染溶血性曼氏杆菌的动物来看，a1、a2和a6血清型占主导地位，a1和a6血清型主要感染牛，而a2血清型主要感染羊。
3、近年来
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种同时检测多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌的检测体系和方法，以解决上述现有技术存在的问题。
2、为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
3、本专利技术提供一种同时检测多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌的检测体系，其特征在于，所述检测体系包括：cas12a蛋白、cas13a蛋白和crrna。
4、优选的是，所述cas12a蛋白为cas12a蛋白或具有与cas12a的旁路单链dna/rna切割活性类似的cas蛋白。
5、优选的是，所述cas13a蛋白为cas13a蛋白或具有与cas13a的旁路单链dna/rna切割活性类似的cas蛋白。
6、优选的是，所述crrna的核苷酸序列如seq id no.7和seq id no.19所示。
7、本专利技术还提供一种非疾病检测或治疗目的地多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌的可视化检测方法，利用所述检测体系对待测样本进行酶切反应，根据反应完成后的荧光颜色判断待测样本中是否含有多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌。
8、优选的是，所述荧光颜色是在蓝光和紫外激发情况下观察反应完成后的荧光颜色。
9、优选的是，当液体激发为绿光时，待测样品中存在多杀性巴氏杆菌；当液体激发为红光时，待测样品中存在溶血性曼氏杆菌；当液体激发为黄色或红-绿-黄时，待测样品中同时存在多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌。
10、优选的是，所述酶切反应的反应体系为：kmt1-crrna-2(0.5μm)、lkt-crrna-6(0.5μm)、cas12a(0.25μm)和cas13a(0.25μm)，kmt1 dna靶标产物500ng、lkt rna靶标产物500ng、ssdna-reporter(joe-6c-bhq1，1.5μm)、ssrna-reporter(rox-5u-bhq2，1.5μm)、rcutsmart buffer 2μl和0.5μl rna酶抑制剂，depc水补齐至20μl；
11、反应程序为：37℃反应15min，然后98℃2min终止反应。
12、本专利技术还提供一种同时检测多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌的产品，包括所述的检测体系。
13、优选的是，所述产品包括试剂或试剂盒。
14、基于上述技术方案，本专利技术具有以下技术效果：
15、本专利技术提供一种同时检测多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌的检测体系以及检测方法，该方法操作简单，适合现场快速检测多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌。
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1.一种同时检测多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌的检测体系，其特征在于，所述检测体系包括：Cas12a蛋白、Cas13a蛋白和crRNA。
2.根据权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述Cas12a蛋白为Cas12a蛋白或具有与Cas12a的旁路单链DNA/RNA切割活性类似的Cas蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的检测体系，其特征在于，所述Cas13a蛋白为Cas13a蛋白或具有与Cas13a的旁路单链DNA/RNA切割活性类似的Cas蛋白。
4.根据权利要求1-3任一项所述的检测体系，其特征在于，所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.19所示。
5.一种非疾病检测或治疗目的地多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌的可视化检测方法，其特征在于，利用权利要求1-4任一项所述检测体系对待测样本进行酶切反应，根据反应完成后的荧光颜色判断待测样本中是否含有多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌。
6.根据权利要求5所述的可视化检测方法，其特征在于，所述荧光颜色是在蓝光和紫外激发情况下观察反应完成后的荧光颜
7.根据权利要求6所述的可视化检测方法，其特征在于，当液体激发为绿光时，待测样品中存在多杀性巴氏杆菌；当液体激发为红光时，待测样品中存在溶血性曼氏杆菌；当液体激发为黄色或红-绿-黄时，待测样品中同时存在多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌。
8.根据权利要求5-7任一项所述的可视化检测方法，其特征在于，所述酶切反应的反应体系为：Kmt1-crRNA-2 0.5μM、LKT-crRNA-6 0.5μM、Cas12a 0.25μM、Cas13a 0.25μM、Kmt1DNA靶标产物500ng、LKT RNA靶标产物500ng、ssDNA-reporter JOE-6C-BHQ1 1.5μM、ssRNA-reporter ROX-5U-BHQ2 1.5μM、rCutSmart Buffer 2μL和RNA酶抑制剂0.5μL，DEPC水补齐至20μL；
9.一种同时检测多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌的产品，其特征在于，包括权利要求1-4任一项所述的检测体系。
...【技术特征摘要】
1.一种同时检测多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌的检测体系，其特征在于，所述检测体系包括：cas12a蛋白、cas13a蛋白和crrna。
2.根据权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述cas12a蛋白为cas12a蛋白或具有与cas12a的旁路单链dna/rna切割活性类似的cas蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的检测体系，其特征在于，所述cas13a蛋白为cas13a蛋白或具有与cas13a的旁路单链dna/rna切割活性类似的cas蛋白。
4.根据权利要求1-3任一项所述的检测体系，其特征在于，所述crrna的核苷酸序列如seq id no.7和seq id no.19所示。
5.一种非疾病检测或治疗目的地多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌的可视化检测方法，其特征在于，利用权利要求1-4任一项所述检测体系对待测样本进行酶切反应，根据反应完成后的荧光颜色判断待测样本中是否含有多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌。
6.根据权利要求5所述的可视化检测方法，其特征在于，所述荧光颜...
【专利技术属性】
技术研发人员：许锋，俄木曲者，徐媛，张林，范景胜，阿果约达，杨世忠，林亚秋，毛鑫，白晟霞，李春枚，李波，闵洁，夏丹，平措，徐存燕，罗锐，
申请(专利权)人：四川省畜牧科学研究院，
类型：发明
国别省市：
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