【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种基于内源i-c型crispr-cas系统的短双歧杆菌基因编辑系统及其应用，属于基因工程和生物工程。
技术介绍
1、双歧杆菌是生命早期定植于人类肠道的共生细菌，在某些情况下占婴幼儿肠道细菌总数的90％以上。某些双歧杆菌菌株因其对人类健康有益而被作为生物活性成分添加到功能性食品中，或者已在商业上用作药物治疗的佐剂。短双歧杆菌是母乳喂养的新生儿肠道微生物群的重要组成部分，具有缓解胃肠道疾病、促进婴儿免疫系统成熟的能力。尽管短双歧杆菌具有多种健康益处，但人们对其益生菌活性的分子机制知之甚少，这阻碍了它们作为益生菌在商业中的应用，也阻碍了短双歧杆菌新功能的发现。事实上，由于短双歧杆菌的细胞壁厚、具有氧气敏感性、限制修饰(r-m)系统活跃以及缺乏遗传工具，对其进行基因操作非常困难。目前常用于短双歧杆菌基因敲除的方法是基于使用非复制质粒的同源重组或通过转座子诱变。但这些方法会将抗生素抗性基因引入基因组中，无法进行连续的基因编辑。此外，低转化效率、低转座效率或低同源重组的发生率可能使得在许多短双歧菌株中难以产生突变体。基因编辑无疑是阻碍短双歧杆菌有益功能背后的分子机制探究的难点，因此亟需完善针对短双歧杆菌的基因编辑系统，以便更有效率地对短双歧杆菌进行改造和功能验证。
2、成簇规则间隔短回文重复序列(crispr)-crispr相关蛋白(cas)系统是细菌抵御外来dna入侵的免疫系统之一，已被用于多种生物体的基因组编辑。基于crispr-cas9的细菌基因编辑最初在大肠杆菌中进行，随后在其他物种中成功实现。然而，编码
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本专利技术提供一种基于内源i-c型crispr-cas系统的短双歧杆菌基因编辑系统。crispr-cas系统广泛存在于短双歧杆菌菌株中(47％)，其中i-c型占比最高。广泛分布的crispr-cas系统为开发基于内源crispr的基因编辑工具箱提供了基础。
2、本专利技术的第一个目的是提供一种短双歧杆菌基因编辑质粒，在大肠杆菌/短双歧杆菌的穿梭质粒pnz123的基础上，构建短双歧杆菌基因编辑系统，不需要克隆外源crispr核酸酶基因，通过利用内源性i-c型crispr系统即可进行基因组的编辑工作。
3、进一步地，所述短双歧杆菌基因编辑系统在载体上插入表达框，所述表达框从5’到3’方向依次包括：天然leader序列、重复序列、sgrna插入位点、重复序列和终止子序列。
4、进一步地，所述载体包括但不限于穿梭质粒pnz123。
5、进一步地，所述的天然leader序列来自于短双歧杆菌crispr阵列前250bp，核苷酸序列如seq id no.1所示。
6、进一步地，所述的重复序列核苷酸序列如seq id no.2所示。
7、进一步地，所述的sgrna插入位点由两个序列相反的bsai酶切位点组成，核苷酸序列如seq id no.3所示。
8、进一步地，所述的终止子核苷酸序列如seq id no.4所示。
9、进一步地，所述载体上还负载有根据靶标位点的上下游分别设计的上下游同源修复模板。
10、进一步地，所述载体上还负载sgrna；所述sgrna通过sgrna插入位点连接到载体上。
11、本专利技术还有一个目的是提供一种利用内源性crispr系统对短双歧杆菌进行基因敲除的方法，包括以下步骤：
12、步骤1：含sgrna的基因编辑系统的构建：根据短双歧杆菌i-c型crispr系统的pam序列为5’-ttc-3’设计sgrna，将所述sgrna连接到权利要求1所述基因编辑系统的sgrna插入位点处，得到质粒pnz624-sgrna；
13、步骤2：基因编辑质粒的构建：根据目标敲除基因的上游和下游序列分别设计引物扩增同源臂，通过重叠延伸pcr将上下游同源臂连接成修复模板，将修复模板克隆至步骤1所述的质粒pnz624-sgrna中，构建敲除质粒；
14、步骤3：基因敲除菌株的获得：将步骤2所述敲除质粒转化至短双歧杆菌中，筛选得到基因敲除突变株。
15、优选的，所述电转至短双歧杆菌感受态内的条件为：电转参数为1500-2500v，质粒添加量为100ng-1μg。
16、本专利技术还提供一种利用内源性crispr系统对短双歧杆菌进行基因点突变的方法，包含以下步骤：
17、步骤1：含sgrna的基因编辑系统的构建：根据短双歧杆菌i-c型crispr系统的pam序列为5’-ttc-3’设计sgrna，将所述sgrna连接到权利要求1所述基因编辑系统的sgrna插入位点处，得到质粒pnz624-sgrna；
18、步骤2：基因编辑质粒的构建：根据目标基因的上游和下游序列分别设计引物扩增同源臂，并将点突变位点设计在同源臂中，通过重叠延伸pcr将点突变位点引入修复模板，将修复模板克隆至步骤1所述的质粒pnz624-sgrna中，构建点突变质粒；
19、步骤3：基因点突变菌株的获得：将步骤2所述点突变质粒转化至短双歧杆菌中，筛选得到基因点突变株。
20、进一步地，点突变位点设计在pam中。
21、优选的，所述电转至感受态短双歧杆菌内的条件为：电转参数为1500-2500v，质粒添加量为100ng-1μg。
22、本专利技术还提供一种利用内源性crispr系统对短双歧杆菌进行基因插入的方法，包含以下步骤：
23、步骤1：含sgrna的基因编辑系统的构建：根据短双歧杆菌i-c型crispr系统的pam序列为5’-ttc-3’设计sgrna，将所述sgrna连接到权利要求1所述基因编辑系统的sgrna插入位点处，得到质粒pnz624-sgrna；
24、步骤2：基因编辑质粒的构建：根据目标基因的上游和下游序列分别设计引物扩增同源臂，并将插入的基因通过重叠延伸pcr连接至修复模板，将修复模板克隆至步骤1所述的质粒pnz624-sgrna中，构建基因插入质粒；
25、步骤3：基因插入菌株的获得：将步骤2所述基因插入质粒转化至短双歧杆菌中，筛选得到基因插入突变株。
26、优选的，所述电转至感受态短双歧杆菌内的条件为：电转参数为1500-2500v，质粒添加量为100ng-1μg。
27、本专利技术还提供一种利用本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于内源I-C型CRISPR系统的短双歧杆菌基因编辑系统，其特征在于，在载体上插入表达框，所述表达框从5’到3’方向依次包括：天然leader序列、重复序列、sgRNA插入位点、重复序列和终止子序列；所述sgRNA插入位点带有两个BsaI酶切位点；所述载体包括但不限于穿梭质粒pNZ123。
2.根据权利要求1所述的基因编辑系统，其特征在于，所述天然leader序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述重复序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述sgRNA插入位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述终止子的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
3.根据权利要求2所述的基因编辑系统，其特征在于，所述载体上还负载根据靶标位点的上下游分别设计的上下游同源修复模板。
4.根据权利要求3所述的基因编辑系统，其特征在于，所述载体上还负载sgRNA；所述sgRNA通过sgRNA插入位点连接到载体上。
5.利用权利要求1～4任一所述基因编辑系统进行短双歧杆菌基因敲除的方法，其特征在于，包含以下步骤：
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