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【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于核苷酸制备领域,具体涉及一种核苷酸纯化方法,尤其涉及一种收率高的核苷酸纯化方法。
技术介绍
1、随着核酸药物及临床快速诊断技术的发展,核酸产业上游原料端质量和成本变得越来越重要。目前核苷酸和脱氧核糖核苷酸方法通常需要进行色谱分离,常规的纯化手段达不到产品质量要求。在目前采用的柱层析方法中,主要包含离子交换洗脱和反相洗脱。其中文献和专利中关于核苷酸分离纯化的研究较少。其中离子交换主要用于ntp(核糖核苷酸)分离纯化,产品纯度一般在95%左右。而反相层析的研究中,由于样品的特殊性,在色谱分离时,流动相一般都会采用三乙胺盐,增加核苷酸在填料上的保留性,应用于核苷酸和寡核苷酸的分离及鉴定。但是该方法使用高压液相色谱,填料和设备价格较高,同时该方法存在载样量低,分离度差等缺陷,导致纯化成本较高。
2、目前市场在售的核苷酸以钠盐或tris盐水溶液为主,这就涉及到将三乙胺盐转为钠盐的工艺。对于核苷酸和多肽转盐,大多数是通过反相色谱技术实现,如专利cn104356224a、cn109438569a和cn107903318a等。专利cn 104356224a采用反相色谱技术制得醋酸盐形式的索玛鲁肽,专利cn109438569a采用反相色谱技术制得醋酸盐形式的利拉鲁肽,专利cn108359006a则通过凝胶色谱法进行转盐制得无盐形式的索玛鲁肽。但上述方法同样使用了较多的有机溶剂、会产生较多的有机废液;葡聚糖凝胶转盐的上样量小、效率偏低,放大生产容易受限;转盐后的样品溶液,也需要经过减压浓缩、去除大部分有机溶剂后,才能进行冻
3、因此,如何提供一种能够有效纯化核苷酸,并能够高效制备核苷酸钠盐的方法,成为了亟待解决的问题。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足,本专利技术的目的在于提供一种核苷酸纯化方法,尤其提供一种收率高的核苷酸纯化方法。本专利技术提供的方法能够有效纯化核苷酸粗品,并通过纳滤方式实现了对洗脱后产品的浓缩和转盐,无需使用任何有机溶剂,降低了成本,减轻了环保压力,提高了产品收率,同时整体方法对设备要求低。
2、为达到此专利技术目的,本专利技术采用以下技术方案:
3、本专利技术提供了一种核苷酸纯化方法,所述核苷酸纯化方法包括以下步骤:
4、将核苷酸粗品进行柱层析分离,之后与钠盐溶液混合纳滤,得到核苷酸钠盐纯品。
5、上述方法通过采用flash柱层析,能够有效纯化包括ntp、dntp(脱氧核糖核苷酸)和修饰核苷三磷酸在内的核苷酸产品,并通过纳滤方式实现了对洗脱后产品的浓缩和转盐,无需使用任何有机溶剂,降低了成本,减轻了环保压力,提高了产品收率,同时整体方法对设备要求低。
6、优选地,所述柱层析的色谱柱为中压柱,填料为c18填料。
7、优选地,所述柱层析的流动相包括流动相a和流动相b,所述流动相a为正己胺水溶液,所述流动相b为甲醇。
8、上述方法通过采用特定流动相和中压色谱,相比常规的高压液相色谱,使得整体设备要求大大降低,减少了成本,还有效提高了合格产品的收率。
9、优选地,所述正己胺水溶液的浓度为30-50 mm,例如30 mm、35 mm、40 mm、45 mm或50 mm等,但不限于以上所列举的数值,上述数值范围内其他未列举的数值同样适用。
10、优选地,所述柱层析的洗脱条件如下:
11、第0-5 min,流动相a的体积分数为75-85%,流动相b的体积分数为15-25%;
12、第5-35 min,流动相a的体积分数由75-85%匀速变为15-25%,流动相b的体积分数由15-25%匀速变为75-85%。
13、优选地,所述柱层析中,核苷酸粗品与填料的质量比为1:(20-100),例如1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90或1:100等,但不限于以上所列举的数值,上述数值范围内其他未列举的数值同样适用。
14、优选地,所述纳滤的过程具体如下:
15、将洗脱液与钠盐溶液第一次混合纳滤,纳滤至原体积后与钠盐溶液第二次混合纳滤,之后与水混合纳滤,至无正己胺后停止。
16、上述方法通过采用钠盐纳滤的方式进行转盐,相比常规的反相色谱法和凝胶色谱法,能够有效提高合格产品的收率,所得样品溶液无需经过减压浓缩即可进行冻干,工艺简单,整体效率更高,同时整体过程无需使用有机溶剂,也不产生有机废液,成本下降的同时,也更为环保。
17、优选地,所述第一次混合纳滤的钠盐溶液的浓度为1.5-2.5 m,例如1.5 m、1.6 m、1.7 m、1.8 m、1.9 m、2 m、2.1 m、2.2 m、2.3 m、2.4 m或2.5 m等,但不限于以上所列举的数值,上述数值范围内其他未列举的数值同样适用。
18、优选地,所述第二次混合纳滤的钠盐溶液的浓度为0.5-1.5 m,例如0.5 m、0.6 m、0.7 m、0.8 m、0.9 m、1 m、1.1 m、1.2 m、1.3 m、1.4 m或1.5 m等,但不限于以上所列举的数值,上述数值范围内其他未列举的数值同样适用。
19、优选地,所述与钠盐溶液混合纳滤前还包括将洗脱液进行浓缩。
20、优选地,所述与钠盐溶液混合纳滤后还包括将纳滤液进行浓缩。
21、优选地,所述浓缩和纳滤采用纳滤卷式有机膜进行。
22、与现有技术相比,本专利技术具有如下有益效果:
23、本专利技术提供了一种核苷酸纯化方法,通过采用flash柱层析,能够有效纯化包括ntp、dntp(脱氧核糖核苷酸)和修饰核苷三磷酸在内的核苷酸产品,并通过纳滤方式实现了对洗脱后产品的浓缩和转盐,无需使用任何有机溶剂,降低了成本,减轻了环保压力,提高了产品收率,同时整体方法对设备要求低。
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1.一种核苷酸纯化方法,其特征在于,所述核苷酸纯化方法包括以下步骤:
2.根据权利要求1所述的核苷酸纯化方法,其特征在于,所述柱层析的色谱柱为中压柱,填料为C18填料。
3.根据权利要求1所述的核苷酸纯化方法,其特征在于,所述柱层析的流动相包括流动相A和流动相B,所述流动相A为正己胺水溶液,所述流动相B为甲醇;
4.根据权利要求3所述的核苷酸纯化方法,其特征在于,所述柱层析的洗脱条件如下:
5.根据权利要求1所述的核苷酸纯化方法,其特征在于,所述柱层析中,核苷酸粗品与填料的质量比为1:(20-100)。
6.根据权利要求1所述的核苷酸纯化方法,其特征在于,所述纳滤的过程具体如下:
7. 根据权利要求6所述的核苷酸纯化方法,其特征在于,所述第一次混合纳滤的钠盐溶液的浓度为1.5-2.5 M;
8.根据权利要求1所述的核苷酸纯化方法,其特征在于,所述与钠盐溶液混合纳滤前还包括将洗脱液进行浓缩。
9.根据权利要求1所述的核苷酸纯化方法,其特征在于,所述与钠盐溶液混合纳滤后还包括将纳滤液进行浓
10.根据权利要求8或9所述的核苷酸纯化方法,其特征在于,所述浓缩和纳滤采用纳滤卷式有机膜进行。
...【技术特征摘要】
1.一种核苷酸纯化方法,其特征在于,所述核苷酸纯化方法包括以下步骤:
2.根据权利要求1所述的核苷酸纯化方法,其特征在于,所述柱层析的色谱柱为中压柱,填料为c18填料。
3.根据权利要求1所述的核苷酸纯化方法,其特征在于,所述柱层析的流动相包括流动相a和流动相b,所述流动相a为正己胺水溶液,所述流动相b为甲醇;
4.根据权利要求3所述的核苷酸纯化方法,其特征在于,所述柱层析的洗脱条件如下:
5.根据权利要求1所述的核苷酸纯化方法,其特征在于,所述柱层析中,核苷酸粗品与填料的质量比为1:(20-100)...
【专利技术属性】
技术研发人员:栗传领,张敏敏,白云涛,赵群,贾媛媛,
申请(专利权)人:天津奥利芙生物技术有限公司,
类型:发明
国别省市:
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