【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本公开文本涉及分子生物学、基因疗法、以及用于修饰rna分子的表达和活性的组合物和方法。相关申请的交叉引用本申请要求2020年12月1日提交的u.s.s.n.63/119,977和2020年12月23日提交的u.s.s.n.63/130,060的权益和优先权，将其各自的内容通过引用以其整体特此并入。通过引用序列表并入将2021年12月1日创建的大小为140kb的名为“locn_008_001wo_seqlist_st25”的文本文件的内容通过引用以其整体特此并入。
技术介绍
1、对于提供有效的基因疗法，特别是靶向引起疾病的潜在致病性rna的基因疗法，本领域存在长期但未满足的需求。
2、已经将超过20个不稳定的微卫星重复扩增(mre)确定为人的神经系统疾病的原因。(rohilla和gagnon,acta neuropahtologica communications,(2017)5:63)。在微卫星重复扩增中由这些重复性mre段表达的致病性rna导致一系列虚弱性疾病和障碍以及通常毁灭性疾病和障碍。这些重复rna、它们在基因中的位置、正常重复长度和引起疾病的重复长度的范围以及临床结局是不同的。不稳定的重复可以位于基因的编码区或非编码区中。可用的治疗方法解决了这些mre疾病的症状，但是不能针对其潜在病因。
3、最常见的通过改变蛋白质生理学而引起疾病的三核苷酸重复是cag mre。cag mre的翻译导致聚q段。许多不同的障碍在基因的编码区都具有cag重复。尽管所得蛋白质的扩增大小、结构、细胞定位和功能不同，但是所
4、hd是由亨廷顿蛋白(htt)基因中的cag重复扩增引起的致命性障碍。所述疾病导致纹状体神经元退化，从而导致运动失控、情绪问题和痴呆。目前，美国有超过40,000名患者，以及超过200,000名处于风险中的患者。
5、扩增cag重复还引起一系列脊髓小脑性共济失调(sca)，迄今为止已经描述了其中九种sca，并且其中sca的子集是由cag mre的存在引起的。sca1是由atxn1基因中cag三核苷酸重复的存在引起的。sca 1型(sca1)是一种罕见的常染色体显性(autodominant)障碍，其特征在于运动进行性问题。sca1症状包括协调和平衡(共济失调)，言语和吞咽困难，肌肉僵硬(痉挛状态)和控制眼球运动的眼部肌肉无力(眼球震颤)，以及与加工、学习和记忆相关的认知损害。在全球每100,000个人中就有1至2人受sca1影响。
6、为了克服针对这些cag mre疾病和障碍的疾病改善疗法的缺乏，需要描述和开发治疗剂以提供有效、持续和可扩展的治疗方法。靶向rna的基因疗法系统对于靶向致病性三核苷酸重复如cag mre是理想的，所述cag mre是所述疾病和障碍的潜在病理学的原因。
7、因此，本公开文本提供了用于在微卫星重复扩增(mre)疾病(称为三核苷酸cag重复障碍，如亨廷顿病(hd)和脊髓小脑性共济失调(sca))中特异性靶向和破坏由重复性段表达的毒性rna的基因疗法组合物和方法。本文提供了能够消除毒性cag重复的靶向rna的基因疗法组合物和系统，以及使用所述靶向rna的基因疗法组合物和系统治疗由cag mre引起的疾病和障碍的方法。
技术实现思路
1、本公开文本提供了用于cag重复障碍的组合物和方法。本文公开的组合物和方法经由破坏或阻断导致cagexp(cag重复扩增)rna的剂量依赖性降低。
2、本公开文本提供了用于治疗由cag mre引起的疾病和障碍的组合物和方法。
3、本文公开了一种治疗哺乳动物的亨廷顿病(hd)的方法，所述方法包括将组合物施用至所述哺乳动物的组织中的毒性靶cag微卫星重复扩增(mre)分子，其中所述组合物包含编码非指导的rna结合融合蛋白的核酸序列，所述非指导的rna结合融合蛋白包含a)能够结合毒性靶cag rna重复序列的puf rna结合序列或cas13d rna结合蛋白，和b)能够切割所述毒性靶cag rna重复序列的核酸内切酶，从而降低所述毒性靶rna的表达水平。
4、本文公开了一种治疗哺乳动物的脊髓小脑性共济失调1型(sca1)的方法，所述方法包括将组合物施用至所述哺乳动物的组织中的毒性靶cag微卫星重复扩增(mre)分子，其中所述组合物包含编码非指导的rna结合融合蛋白的核酸序列，所述非指导的rna结合融合蛋白包含a)能够结合毒性靶cag rna重复序列的puf rna结合序列或cas13d rna结合蛋白，和b)能够切割所述毒性靶cag rna重复序列的核酸内切酶，从而降低所述毒性靶rna的表达水平。
5、本公开文本提供了一种组合物，所述组合物包含编码rna结合多肽的核酸序列，所述rna结合多肽包含能够结合毒性靶cag重复rna序列的非指导的rna结合多肽或指导的rna结合多肽。
6、在一些实施方案中，所述rna结合多肽是融合蛋白。在一些实施方案中，所述融合蛋白包含所述rna结合多肽，所述rna结合多肽与能够切割所述毒性cag重复rna序列的核酸内切酶融合。
7、在一些实施方案中，所述非指导的rna结合多肽是puf或pumby蛋白。在一些实施方案中，所述指导的rna结合多肽是cas13d蛋白。在一些实施方案中，所述cas13d蛋白是无催化活性的。
8、在一些实施方案中，所述cas13d蛋白包含seq id no:587或590-594中任一个所示的氨基酸序列。
9、在一些实施方案中，所述核酸内切酶是zc3h12a锌指核酸内切酶的核酸酶结构域。
10、在一些实施方案中，所述puf rna结合蛋白包含seq id no:444-451、461、480-488、549-557或656中任一个所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述puf rna结合蛋白包含seq id no:549或480中所示的氨基酸序列。
11、在一些实施方案中，所述毒性靶cag rna重复序列包含seq id no:453-456或472-479中所示的核酸序列中的任一种。在一些实施方案中，所述毒性靶cag rna重复序列包含seq id no:453或472中任一个所示的核酸序列。
12、在一些实施方案中，所述靶向cag的puf蛋白由seq id no:577、581、614、619、621或622中所示的核酸序列编码。
13、在一些实施方案中，其中所述puf或pumby蛋白是人puf或pumby蛋白。在一些实施方案中，所述puf或pumby蛋白通过接头序列与所述zc3h12a核酸内切酶连接。
14、在一些实施方案中，所述接头包含seq id no:411中所示的氨基酸序列。
15、在一些实施方案中，所述融合蛋白包含选自核定位序列(nls)和核输出序列(nes)的一个或多个信号序本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种组合物，所述组合物包含编码RNA结合多肽的核酸序列，所述RNA结合多肽包含能够结合毒性靶CAG重复RNA序列的非指导的RNA结合多肽或指导的RNA结合多肽。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述RNA结合多肽是融合蛋白。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述融合蛋白包含所述RNA结合多肽，所述RNA结合多肽与能够切割所述毒性CAG重复RNA序列的核酸内切酶融合。
4.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述非指导的RNA结合多肽是PUF或PUMBY蛋白。
5.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述指导的RNA结合多肽是Cas13d蛋白。
6.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述cas13d蛋白是无催化活性的。
7.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述cas13d蛋白包含SEQ ID NO:587或590-594中任一个所示的氨基酸序列。
8.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述核酸内切酶是ZC3H12A锌指核酸内切酶的核酸酶结构域。>
9.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述PUF RNA结合蛋白包含SEQ IDNO:444-451、461、480-488、549-557或656中任一个所示的氨基酸序列。
10.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述PUF RNA结合蛋白包含SEQ IDNO:549或480中所示的氨基酸序列。
11.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述毒性靶CAG RNA重复序列包含SEQ ID NO:453-456或472-479中所示的核酸序列中的任一种。
12.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述毒性靶CAG RNA重复序列包含SEQ ID NO:453或472中任一个所示的核酸序列。
13.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述靶向CAG的PUF蛋白由SEQ IDNO:577、581、614、619、621或622中所示的核酸序列编码。
14.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述PUF或PUMBY蛋白是人PUF或PUMBY蛋白。
15.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述PUF或PUMBY蛋白通过接头序列与所述ZC3H12A核酸内切酶连接。
16.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述接头包含SEQ ID NO:411中所示的氨基酸序列。
17.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述融合蛋白包含选自核定位序列(NLS)和核输出序列(NES)的一个或多个信号序列。
18.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述ZC3H12A锌指核酸酶包含SEQID NO:358或SEQ ID NO:359中所示的氨基酸序列。
19.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述融合蛋白包含SEQ ID NO:460中任一个所示的氨基酸序列。
20.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述融合蛋白由包含SEQ ID NO:574-582的核酸序列编码。
21.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中编码所述融合蛋白的核酸分子包含启动子。
22.根据权利要求14所述的组合物，其中所述启动子是tCAG启动子、EFS/UBB启动子或突触素启动子。
23.一种载体，所述载体包含根据前述权利要求中任一项所述的组合物。
24.根据权利要求23所述的载体，其中所述载体选自：腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、纳米颗粒、胶束、脂质体、阳离子脂质体/DNA复合物、聚合物囊泡、多聚复合物和树状聚合物。
25.根据权利要求23所述的载体，所述载体是AAV载体。
26.根据前述权利要求中任一项所述的AAV载体，其中所述AAV载体包含：
27.根据前述权利要求中任一项所述的AAV载体，其中所述CAG重复RNA结合多肽包含PUF或PUMBY蛋白。
28.根据前述权利要求中任一项所述的AAV载体，其中编码所述PUF或PUMBY序列的多核苷酸序列包含SEQ ID NO:577、581、614、619、621或622中所示的核酸序列。
29.根据前述权利要求中任一项所述的AAV载体，其中所述CAG重复RNA结合多肽包含Cas13d蛋白。
30.根据前述权利要求中任一项所述的AAV载体，其中编码所述Cas13d序列的多核苷酸序列包含SEQ ID...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种组合物，所述组合物包含编码rna结合多肽的核酸序列，所述rna结合多肽包含能够结合毒性靶cag重复rna序列的非指导的rna结合多肽或指导的rna结合多肽。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述rna结合多肽是融合蛋白。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述融合蛋白包含所述rna结合多肽，所述rna结合多肽与能够切割所述毒性cag重复rna序列的核酸内切酶融合。
4.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述非指导的rna结合多肽是puf或pumby蛋白。
5.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述指导的rna结合多肽是cas13d蛋白。
6.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述cas13d蛋白是无催化活性的。
7.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述cas13d蛋白包含seq id no:587或590-594中任一个所示的氨基酸序列。
8.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述核酸内切酶是zc3h12a锌指核酸内切酶的核酸酶结构域。
9.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述puf rna结合蛋白包含seq idno:444-451、461、480-488、549-557或656中任一个所示的氨基酸序列。
10.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述puf rna结合蛋白包含seq idno:549或480中所示的氨基酸序列。
11.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述毒性靶cag rna重复序列包含seq id no:453-456或472-479中所示的核酸序列中的任一种。
12.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述毒性靶cag rna重复序列包含seq id no:453或472中任一个所示的核酸序列。
13.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述靶向cag的puf蛋白由seq idno:577、581、614、619、621或622中所示的核酸序列编码。
14.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述puf或pumby蛋白是人puf或pumby蛋白。
15.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述puf或pumby蛋白通过接头序列与所述zc3h12a核酸内切酶连接。
16.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述接头包含seq id no:411中所示的氨基酸序列。
17.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述融合蛋白包含选自核定位序列(nls)和核输出序列(nes)的一个或多个信号序列。
18.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述zc3h12a锌指核酸酶包含seqid no:358或seq id no:359中所示的氨基酸序列。
19.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述融合蛋白包含seq id no:460中任一个所示的氨基酸序列。
20.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述融合蛋白由包含seq id no:574-582的核酸序列编码。
21.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中编码所述融合蛋白的核酸分子包含启动子。
22.根据权利要求14所述的组合物，其中所述启动子是tcag启动子、efs/ubb启动子或突触素启动子。
23.一种载体，所述载体包含根据前述权利要求中任一项所述的组合物。
24.根据权利要求23所述的载体，其中所述载体选自：腺相关病毒(aav)、逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、纳米颗粒、胶束、脂质体、阳离子脂质体/dna复合物、聚合物囊泡、多聚复合物和树状聚合物。
25.根据权利要求23所述的载体，所述载体是aav载体。
26.根据前述权利要求中任一项所述的aav载体，其中所述aav载体包含：
27.根据前述权利要求中任一项所述的aav载体，其中所述cag重复rna结合多肽包含puf或pumby蛋白。
28.根据前述权利要求中任一项所述的aav载体，其中编码所述puf或...
【专利技术属性】
技术研发人员：D·A·内尔斯，R·巴特拉，D·罗斯，D·齐苏里斯，A·塔，
申请(专利权)人：洛卡纳生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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