【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物检测，具体涉及一种快速定量检测猪肺炎支原体特异性siga抗体的方法。
技术介绍
1、猪气喘病(mps)是由猪肺炎支原体(mhp)引起的一种慢性、接触性传染病。经呼吸道感染后引起呼吸道纤毛的萎缩、损坏、脱落，进而降低了呼吸道粘膜的免疫功能，引起肺部功能性的损伤。该病虽然不造成急性大面积死亡，但发病率较高，猪只一旦感染该病后即会出现喘气、咳嗽等症状，严重影响着猪群的生长发育，造成生长发育迟缓及饲料转化率低等。在当前非洲猪瘟疫情的影响下，该病的发生严重制约着猪的出栏率及饲料回报率。因此，一旦发生该病将给猪场造成严重的经济损失。
2、研究表明，对mps的预防主要通过呼吸道局部的细胞免疫和粘膜免疫。分泌型iga(siga)是参与粘膜免疫反应的主要效应因子，是机体免疫系统中的重要组成部分，在免疫应答中起着重要作用。抗猪肺炎支原体siga是mhp感染和免疫后首先产生的特异性标志，同时也能更好的反映出猪群免疫猪肺炎支原体疫苗后的免疫效果。因此猪群的感染情况可以通过抗体水平的情况得到更好的评定。
3、目前，对于猪支原体肺炎抗体的检测方法主要是：针对血清中特异性igg、鼻拭子中特异性iga抗体的elisa检测方法，这些检测结果的评定需要依赖于临床猪群的免疫及健康情况，通常依据猪群有无免疫过猪肺炎支原体相关疫苗、有无出现类似于猪气喘病症状，以及通过解剖分析肺部变化来进行判定。判定标准存在一定的主观性，且成本要求较高。中国兽医药品监察所建立的微量间接血凝试验(iha)尽管在国内应用比较多，但iha的检测中存在着
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种快速定量检测猪肺炎支原体特异性siga抗体的方法。
2、猪肺炎支原体属于兼性厌氧菌，通过消耗葡萄糖产生乳酸或者二氧化碳和水，导致猪肺炎支原体培养基中酚红指示剂发生颜色变化。葡萄糖与3,5-二硝基水杨酸(dns)在碱性加热条件下，被还原成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，该物质在od540nm处有最大的吸光度。正常情况下，猪肺炎支原体在培养过程中因为葡萄糖消耗量的变化，导致培养基中ph值的发生改变，进而出现颜色反应。当猪肺炎支原体特异性siga抗体与猪肺炎支原体结合后，能够消耗葡萄糖的猪肺炎支原体减少。因此，可依据棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸在od540nm吸光值的变化进行培养基中剩余葡萄糖的测定，进而可以计算出猪肺炎支原体特异性siga抗体结合猪肺炎支原体后培养基中未消耗的葡萄糖的量。通过od540nm变化可以间接测定出猪肺炎支原体特异性siga抗体的含量变化。为了进一步确定特异性siga抗体的含量，本专利技术依据已知浓度特异性siga抗体与猪肺炎支原体结合后培养基中不同od540nm值制作曲线，即可根据待检样本中od540nm值，计算出待检样本中特异性siga抗体的浓度。因此，可以通过测定猪肺炎支原体培养基中剩余葡萄糖的量的方法，间接对猪肺炎支原体特异性siga抗体进行定量检测。
3、为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：
4、一种快速定量检测猪肺炎支原体特异性siga抗体的方法，包括以下步骤：
5、1)猪肺炎支原体培养物制备
6、将经过复苏、培养至对数生长期且效价达到108ccu/ml的新鲜的猪肺炎支原体按照20％的接种比例接种于培养基中，得到猪肺炎支原体培养物。
7、2)特异性siga抗体阴阳性对照的制备及标定
8、2-1)特异性siga抗体阳性对照的制备：选取经猪肺炎支原体抗体和抗原检测均为阴性的25～30日龄仔猪，对猪只进行猪肺炎支原体活疫苗(168株)免疫，1头份/只，2周后加强免疫1次，2头份/只，加强免疫后4～6周采集肺泡进行特异性siga抗体的制备，收获的液体经500g离心10min后，16260g离心30min，收获的上清经无菌处理后即为猪肺炎支原体特异性siga抗体阳性对照；
9、2-2)特异性siga抗体阴性对照的制备：经猪肺炎支原体抗原和抗体检测均为阴性25～30日龄仔猪，取其肺进行肺泡液的灌洗、收集，500g离心10min，16260g离心30min，收获的上清液经无菌处理后即为猪肺炎支原体特异性siga抗体阴性对照；
10、2-3)特异性siga的含量标定；采用已知浓度的siga对阳性对照品中siga的含量进行标定；
11、2-3-1)猪源sc重组蛋白的制备
12、从genbank中获取猪源sc基因序列，经过密码子偏好性优化后，合成并插入到pet32a表达载体中；挑选经序列测定阅读框编码正确的单菌落接种到5ml菌液中，180-190r/min 37℃过夜培养，次日按照1:100的比例进行大量培养，37℃、210r/min培养3h后，加入终浓度为0.2mmol/l的iptg，诱导5h后收菌，16260g离心20min，弃上清，沉淀用预冷的pbs洗涤2次，16260g离心15min，弃上清后，将沉淀用超声破碎仪破碎处理(300w)，超3s停5s，超声处理20min～30min，将残留的沉淀采用2mol/l脲洗涤2次，16260g离心15min，弃除上清，沉淀用8mol/l脲4℃过夜溶解后，离心处理，16260g离心15min，弃除沉淀，将上清液进行镍柱、离子交换等进行纯化，获取纯化的猪源sc重组蛋白；
13、2-3-2)特异性siga抗体阳性对照含量的标定
14、因sc蛋白是siga的特异性组成成分(siga是由2个iga和j链、sc分泌片组成)，将猪源sc重组蛋白进行浓度测定后，包被于elisa酶标板中，2μg/孔，37℃孵育2h，pbst洗涤，拍干；2％bsa封闭2h；pbst洗涤，拍干，加入1:5～1：20倍稀释的特异性siga抗体阳性对照和已知浓度的siga样品，37℃孵育45min，pbst洗涤后，加入1：2000倍稀释的羊抗猪iga-hrp(辣根过氧化物酶标记的iga抗体)抗体，tmb底物显色液显色后，2mol/l的h2so4终止，进行od450nm测定，以已知浓度的siga抗体浓度为横纵标，以450nm吸光值为纵坐标，绘制特异性siga标准曲线图，根据已知siga的浓度计算出特异性siga抗体阳性对照的浓度，随后对特异性siga进行稀释，选择线性关系较好的特异性siga抗体浓度区间进行样本中抗体浓度的测定(r2>0.98)。该步骤的设定主要目的：1、测定特异性siga抗体阳性对照的浓度；2.确定不同浓度的特异性siga抗体阳性对照与猪肺炎支原体结合后，能够形成较好相关性的特异性siga抗体的浓度区间，以便确定后期测定本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种快速定量检测猪肺炎支原体特异性SIgA抗体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求所述的一种快速定量检测猪肺炎支原体特异性SIgA抗体的方法，其特征在于，步骤1）中，所述猪肺炎支原体是经过复苏、培养至对数生长期且效价达到108CCU/mL的新鲜的猪肺炎支原体。
3.根据权利要求所述的一种快速定量检测猪肺炎支原体特异性SIgA抗体的方法，其特征在于，步骤2-1）中，收获的液体经500g离心10min后，再经16260g离心30min，收获上清经无菌处理后，即为猪肺炎支原体特异性SIgA抗体阳性对照。
4.根据权利要求所述的一种快速定量检测猪肺炎支原体特异性SIgA抗体的方法，其特征在于，步骤2-2)中，收获的液体经500g离心10min，再经16260g离心30min，收获上清液，即为猪肺炎支原体特异性SIgA抗体阴性对照。
5. 根据权利要求所述的一种快速定量检测猪肺炎支原体特异性SIgA抗体的方法，其特征在于，步骤2-3）中所述特异性SIgA的含量标定方法如下：
【技术特征摘要】
1.一种快速定量检测猪肺炎支原体特异性siga抗体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求所述的一种快速定量检测猪肺炎支原体特异性siga抗体的方法，其特征在于，步骤1）中，所述猪肺炎支原体是经过复苏、培养至对数生长期且效价达到108ccu/ml的新鲜的猪肺炎支原体。
3.根据权利要求所述的一种快速定量检测猪肺炎支原体特异性siga抗体的方法，其特征在于，步骤2-1）中，收获的液体经500g离心10min后，再经16260g离心30...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱海侠，陈雷，傅星源，潘小慧，叶晓慧，张惠云，
申请(专利权)人：兆丰华生物科技福州有限公司，
类型：发明
国别省市：
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