由茶树叶生产微体幼芽的一步法制造技术

本发明专利技术提供了从经愈伤组织相的叶外植体微体繁殖茶树的一步法，其中从愈伤组织的诱导阶段至生根和幼芽形成的阶段，将外植体在补充有维生素例如维生素Ｂ↓［１］－ＨＣｌ（０．０５－２．０ｍｇ／ｌ）、维生素Ｂ↓［６］－ＨＣｌ（０．２５－１．５ｍｇ／ｍｌ）和烟酸（０．２５－１．５ｍｇ／ｌ）与甘氨酸（１．０－３．０ｍｇ／ｌ）以及２．５、５．０或７．５ｍｇ／ｌ的２，４－二氯苯氧乙酸的基本Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ和Ｓｋｏｏｇ培养基中保持１４－１６周。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术涉及一种由茶树叶生产微体幼芽的新一步法。茶是一种受欢迎的具有抗癌特性的含咖啡因饮料(Jankun等，为什么饮茶可以预防癌症，《自然》(Nature)5561；1997)。虽然山茶属有许多种，但仅C.sinensis(L.)O.Kuntze或茶及其诸如Chinary、Assamica和Cambod的不同栽培品种在商业上是很重要的(Braua D.N.“茶树贸易”于Barua D.N.编辑，《茶叶栽培中的科学和实践》中，加尔各答茶研究协会；53-68；1989)。茶叶栽培不仅是重要的职业提供源、而且也是世界所有茶叶生长地区挣取外汇的主要途径(Wilson，K.C.编辑的《咖啡、可可和茶》中的“植物学和植物改良”，CABI出版，Wallingford，UK167-173；1999)。但是，茶叶的总产量不足以满足本国和世界市场的需要(Kabra，G.D.，1999年茶叶统计资料，《茶时代》(Tea time)Vol VIII，No.3 9-11，99，30-31；1999)。由于不同的生命性的(真菌、害虫和病毒)和非生命的(冰冻、冰雹、寒冷、干旱、营养不良等)应力使茶叶的产率和质量进一步降低(Wilson，K.C.编辑的《咖啡、可可和茶》中的“植物学和植物改良”，CABI出版，Wallingford，UK167-173；1999)。实际属于木本树种的茶树具有较长的生活周期以及高度自身不相容性和近亲繁殖萧条(Barua D.N.编辑，《茶叶栽培中的科学和实践》中的Barua D.N.“茶树贸易”，加尔各答茶研究协会；53-68；1989)，这通常限制了通过常规的育种方法生产高产率且优等和抗应力茶树。因此，生物技术方法的应用是一种有效且可供选择的方法。但是，预先必备一种有效率且能繁殖的再生方法对于生物技术应用是最重要的。茶叶中的最严重问题是水疱枯萎病，因为它侵害用于制茶的叶子和幼芽，结果产率下降了50％。因此，抑制水疱枯萎病对于弥补这些损失是非常急需的。已确定了一些具有高产率和高质量但易患水疱枯萎病的克隆，因此需要通过诸如叶外植体的同源组织的生物技术改良，因为诸如子叶外植体的异质组织会导致基因分离和所需的高产率和高质量的特性的丧失。因此，现存的方法在于诸如子叶外植体的异质组织不具有上述有关用途并且还需要保持优良植物特性类型的准确。因此，急需发展采用同源组织的微体繁殖的方法。叶外植体的再生是最佳的优选，因为(i)叶外植体是同源的；(ii)叶外植体的再生总是产生忠实于原始的选择性优良特性类型的植物；(iii)叶子含有极大量复制数的叶绿体DNA，因此在进行任何基因操作时如转基因或体细胞杂交的研制中使用叶子，则叶子表达可以扩增数倍；(iv)叶子为任何基因操作技术提供了大量表面；(v)叶子是市售的成品茶的主要商业来源；(vi)叶子提供了丰富的原料供应；(vii)采用叶子作为外植体不会防碍一般的好的特性和植物的生长；倘若在再生过程中没有出现体细胞克隆变异，那么通过体细胞杂交或通过转基因技术的生物技术作物改良通常需要经愈伤组织相的再生。由于茶树寿命长，与快速生长的草本植物相比，愈伤组织相中的染色体变异的可能性要低。因此，本申请报道了使用经愈伤组织相的微体繁殖茶树的有效一步法。如果使用叶外植体或如果植物为50年或更长的非常老的树，木本植物的再生能力很差。为了产生经体细胞胚胎发生的植物或经愈伤组织相的未定形幼芽形成，但要么转化频率低(4-6％)或要么生根很少，已将叶外植体用于山茶属的其它观赏植物种中，即C.japonica和C.reticulata(Sanjose，M.C.和Vieitez，A.M.成熟Camellia reticulata的体外叶子的未定形幼芽再生，《园艺科学杂志》(J.Hort.Sci.)67677-683；1992；Sanjose，M.C.和Vieitez，A.M.“通过胚胎发生和柄茎发生来源于叶外植体培养物的山茶属小植株的再生”，《园艺科学》(Sci.Horti.)，54303-315；1993；Pedroso，M.C.和Pais，M.S.的C.japonica L.叶中的直接胚胎形成”，《植物细胞再配(Rep.)》12639-643；1993)。而且，这些均是观赏植物种。但是，没有有关通过茶即商用的山茶属或茶树中的愈伤组织、用于未定形幼芽形成的叶外植体的植物再生的方法的报道。至今也没有从茶或任何其它观赏植物种中的叶外植体再生幼芽的一步法的报道。为了研究叶外植体的再生方法，Nakamura Y.在1984年做了首次尝试(茶树体外繁殖的有效方法，Proc.Internat.Symp.有关茶叶产量的最近发展，中国，台湾，198463-74页)，其中愈伤组织是在补充有茁长素2，4-二氯苯氧乙酸的Nitsch和Nitsch培养基(Nitsch，J.P.和Nitsch C.，来源于花粉粒的单倍体植物，《科学》(Sci.)(Washington)，16385-87；1969)和Gamborg培养基(Gamborg，O.L.，Miller，R.A.和Ojima，K.大豆根细胞的悬浮液培养物的营养需要，《实验细胞研究》50151-58；1968)中获得的。该方法的缺点是尽管在形态发生的不同步骤中使用了不同的培养基，但未能获得形态发生或未定形幼芽形成。在1985年，Nakamura(Nakamura，Y.外植体的起源对茶树组织培养中的根的分化和其不同品种的影响，Shizuoka茶实验站621-8；1985)和Palni、Sood、Chand、Sharma、Rao和Jain(Palni，L.M.S.Sood，A.，Chand，G.，Sharma，M.，Rao，D.V.，Jain，N.K.茶中的组织培养研究，Proc.International Sym.有关茶叶科学，Shizuoka，日本，395-399，1991)又尝试了经愈伤组织相的叶外植体的植物再生，其中从叶愈伤组织中获得了生根或根形成，但是缺点是这种生根愈伤组织没有产生根并且使用了两种不同的培养基。此后，直至1996年才有有关叶外植体的植物再生的报道，其中Kato(Kato，M.体外生长的茶幼芽的未成熟叶的体细胞胚胎发生，《植物细胞再配(Rep.)》15920-926；1996)从来源于Murashige和Skoog培养基(Murashige T.和Skoog F.A用于烟草组织培养的快速生长和生物测定的改进培养基，《植物生理学》(Physiol.Plant)15473-497；1962)中的体外生长植物的叶外植体的体细胞胚胎得到了一些植物，该培养基补充在液体中的0.5mg/l的2，4-二氯苯氧乙酸和0.8％琼脂固化培养基中的5mg/l的2，4-二氯苯氧乙酸。Kato的方法的主要缺点列举如下(i)有关体细胞胚胎诱导的外植体应答的百分比非常低(6％)；(ii)供体植物是导致子代中的基因变异的树苗；(iii)体细胞胚胎转化为植物的频率非常低，即7.1％；(iv)将被诱导的胚胎控制在叶的特定区域内、而不从所有叶表面为它们提供不适合的转基因研究；(v)不包括用于从具有优良特性的成熟的选择性矮树丛中培养叶外植体的系统，而包括从树苗的叶外植体中的胚胎发生愈伤组本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从茶树叶外植体生产微幼芽的新的一步方法，它包括约１０－１６周，其中： （ａ）切除来源于用于愈伤组织诱导的体外培养的茶树植物的外植体，该外植体在补充有选自维生素Ｂ↓［１］－ＨＣｌ（０．０５－２．０ｍｇ／ｌ）、维生素Ｂ↓［６］－ＨＣｌ（０．２５－１．５ｍｇ／ｍｌ）和烟酸（０．２５－１．５ｍｇ／ｌ）与甘氨酸（１．０－３．０ｍｇ／ｌ）、２，４－二氯苯氧乙酸（５．０－１０ｍｇ／ｌ）的维生素的标准基本Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ和Ｓｋｏｏｇ培养基中保持２－４周，优选２周后， （ｂ）４－６周后将愈伤组织培养物保持在用于生根或根形成的同样但部分减少了的培养基中， （ｃ）４－６周后使生根愈伤组织在同样但几乎干燥且减少了的培养基中生根， （ｄ）将用于繁殖的步骤（ｃ）形成的幼芽转移至含补充有５μＭ苯基噻二唑基脲的液体培养基的繁殖培养基中， （ｅ）切断长幼芽的末端至少约３．０ｃｍ，用吲哚－３－丁酸处理幼芽末端２０－３０分钟、将其转移并保持在含沙土混合物（１∶１）的广口瓶中至少６０－７５天得到小植株， （ｆ）将小植株转移至开口的塑料罐中得到健壮的有活力的茶树。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种从茶树叶外植体生产微幼芽的新的一步方法，它包括约10-16周，其中(a)切除来源于用于愈伤组织诱导的体外培养的茶树植物的外植体，该外植体在补充有选自维生素B1-HCl(0.05-2.0mg/l)、维生素B6-HCl(0.25-1.5mg/ml)和烟酸(0.25-1.5mg/l)与甘氨酸(1.0-3.0mg/l)、2，4-二氯苯氧乙酸(5.0-10mg/l)的维生素的标准基本Murashige和Skoog培养基中保持2-4周，优选2周后，(b)4-6周后将愈伤组织培养物保持在用于生根或根形成的同样但部分减少了的培养基中，(c)4-6周后使生根愈伤组织在同样但几乎干燥且减少了的培养基中生根，(d)将用于繁殖的步骤(c)形成的幼芽转移至含补充有5μM苯基噻二唑基脲的液体培养基的繁殖培养基中，(e)切断长幼芽的末端至少约3.0cm，用吲哚-3-丁酸处理幼芽末端20-30分钟、将其转移并保持在含沙土混合物(1∶1)的广口瓶中至少60-75天得到小植株，(f)将小植株转移至开口的塑料罐中得到健壮的有活力的茶树。2.如权利要求1所述的方法，其中外植体是选自Chinary、Assamica和Cambod的茶叶栽培品种。3.如权利要求1所述的方法，其中通过诱导叶外植体中的分生组织的活性，来源于任何茶树栽培品种及其杂交体的叶外植体被用于间接幼芽形成。4.如权利要求1所述的方法，其中通过诱导叶外植体中的分生组织的活性，来源于生长体内和体外条件下的选择...

【专利技术属性】
技术研发人员：因德拉桑达尔，阿米塔巴塔查里亚，马杜夏尔马，PS阿胡贾，
申请(专利权)人：科学与工业研究委员会，
类型：发明
国别省市：IN[印度]