【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，尤其是涉及一种小脑中组织结构的无标记实时活体成像系统及方法。
技术介绍
1、研究小脑皮层的结构对理解小脑的功能、发育过程及其与疾病关系至关重要。传统研究有很多离体以及在体的脑皮层不同结构的成像方法，例如离体组织切片的免疫组化染色，但经过处理后的组织在形态结构上和在体时会有很大差异，无法反映真实生理状态下的结构。此外，在体的成像方法，例如多光子成像，往往需要使用外源性的荧光材料或者用荧光蛋白转染，来对特定的组织结构进行标记后，再进行成像。其他一些例如超声、磁共振等成像手段无需标记，但受限于空间分辨率，很难实现高分辨率结构成像。所以目前的研究和技术还没有一种在小脑上使用的无标记、在体实时成像方法，能实现对小脑内髓鞘和轴突等神经纤维、神经细胞、血管和白质等不同结构同时进行无标记实时成像。
技术实现思路
1、为了解决
技术介绍
中存在的问题，本专利技术给出了一种小脑中组织结构的无标记实时活体成像系统及方法，结合三光子荧光显微镜系统，利用脑组织的特定几何形状和脂质含量进行三次谐波产生(thg)成像，实现对小脑内亚细胞尺度如髓鞘和轴突等神经纤维、血管、神经纤维以及白质层不同结构进行在体的、无创的无标记实时活体成像。
2、这种方法可实时观测的小脑内不同组织的结构，有望为小脑的发育、健康和疾病状态下小脑功能研究提供全新的更快、可重复以及高分辨率的成像技术手段。
3、本专利技术解决技术问题所采用的技术方案如下：
4、本专利技术中的实时活体成像系统用
5、所述的实验对象为实验动物的小脑，所述实验动物包括但不限于小鼠。
6、所述成像仪器包括飞秒激光器、非共线光学参量放大器和振镜组，所述飞秒激光器产生飞秒激光作为成像光束，成像光束经非共线光学参量放大器调制功率后入射到振镜组，成像光束经振镜组控制激光光路后传输至所述多光子显微镜。
7、所述成像仪器还包括调制器，所述调制器连接到非共线光学参量放大器，调制器产生电信号作为调制信号，调制信号用于控制非共线光学参量放大器对成像光束的激光参数进行调制，经过非共线光学参量放大器后的最大激光功率为700～1600mw，所述成像光束经振镜组传输后，成像光束的功率为5～20mw，具体功率可根据目标成像区域的深度进行调节。
8、所述成像光束的飞秒激光波长为1200～1800nm，脉冲宽度小于1ps。
9、所述实时成像系统还包括主控电脑，所述主控电脑用于设置多光子显微镜的图像采集参数以及存储图像数据。
10、所述图像采集参数包括：图像视野大小fov、像素点和扫描时间。
11、优选地，所述图像视野大小fov为300*300至500*500微米，像素点为1024*1024，扫描时间为1.2～2.0μs/pixel。
12、优选地，所述多光子显微镜为三光子显微镜。
13、所述的实验对象未注射任何外源性的荧光材料，即实验对象的目标成像区域未标记荧光标记物，成像过程中仅利用组织自身的特定几何形状和脂质含量来实现无标记成像。
14、所述小脑皮层的组织包括小脑皮层血管、神经细胞、神经纤维。
15、所述小脑皮层血管包括分子层的大血管、从分子层垂直向下贯穿至颗粒层的血管、浦肯野层和颗粒层的血管；
16、所述神经细胞包括小脑分子层的中间神经元、浦肯野层的浦肯野细胞、颗粒层的中间神经元；
17、所述神经纤维包括小脑分子层中间神经元的轴突、浦肯野细胞的轴突、颗粒层的攀缘纤维和苔状纤维。
18、所述实时成像方法的具体步骤为：
19、s1)将实验对象置于多光子显微镜的成像平台上后，飞秒激光器产生成像光束，成像光束经过非共线光学参量放大器、振镜组后传输至多光子显微镜；
20、s2)多光子显微镜控制成像光束聚焦后入射到实验对象的目标成像区域后，多光子显微镜控制成像光束按照预先设置的图像采集参数对目标成像区域进行扫描，获得目标成像区域内组织的结构图像数据，对结构图像数据进行数据处理和三维重构后，获得目标成像区域内组织的三维结构图像。
21、所述步骤s2)中，成像光束扫描目标成像区域的具体步骤为：
22、成像光束聚焦后入射到目标成像区域的预设深度的平面上，以成像光束在预设深度的平面上的聚焦点为扫描点，扫描点在连续点扫描的模式下，以1.2～2.0μs/pixel的超快点扫描速度在预设深度的平面行进扫描，在预设深度的平面进行4～8次扫描后，通过叠加平均去噪获得所述预设深度的平面上的高信噪比图像数据。
23、所述步骤s2)中，在深度方向，以1微米的间隔扫描目标成像区域不同深度的平面，即相邻两次扫描的平面深度差为1微米。
24、本专利技术创造性地采用了三光子荧光显微镜系统结合1200～1800nm波长的超快飞秒激光，利用脑组织的特定几何形状和脂质含量进行三次谐波产生成像，提供了一种无标记的小脑结构实时活体成像方法，实现了对小脑内血管、神经细胞、神经纤维以及白质层不同组织结构进行快速的、在体的、无标记实时成像，为小脑的发育、健康和疾病状态下的结构及功能研究提供了重要工具。本专利技术将thg成像原理结合三光子显微技术在小脑上实现高分辨率、高穿透深度的无标记结构成像。
25、本专利技术的有益效果是：
26、1、灵活简便可重复性强。本专利技术利用三次谐波成像的原理，根据脑内不同组织自身的几何形状和脂质含量不同来进行成像，不需要注射外源性的荧光标志物或者使用价格昂贵的转基因小鼠，也无需转染带荧光蛋白的腺相关病毒等待1～2周才能进行实验，本专利技术所述的在体实时成像方法，无需标记，操作起来简便灵活且可以多次重复成像动态变化。
27、2、可靠安全低损伤。因为无需外源性的荧光标志物，避免了外源物对实验对象的病理毒性作用，同时也避免了导入外源性荧光标志物的实验操作对实验对象造成物理性损伤；此外，荧光标志物的缺乏也减少了组织对激光能量的吸收，减少了光热损伤的影响。
28、3、高分辨率和深度成像。本方法利用了三光子荧光显微镜系统，使用1200～1800nm波长的飞秒激光扫描成像，该波段的激光具有极好的组织穿透能力，使用较低功率的激光即可穿透皮层，可实现小脑白质成像。同时在低功率激光下，可通过增加图像点扫描时间以及单个深度平面重复平均次数等方式，使图像分辨率和信噪比最大化。
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1.一种小脑中组织结构的无标记实时活体成像系统，其特征在于：所述实时活体成像系统用于获取实验对象目标成像区域内不同组织的结构图像，所述实时活体成像系统包括成像仪器和多光子显微镜，所述成像仪器产生飞秒激光作为成像光束传输至多光子显微镜，多光子显微镜将成像光束聚焦后入射到实验对象的目标成像区域，所述的目标成像区域为小脑皮层及白质层。
2.根据权利要求1所述的小脑中组织结构的无标记实时活体成像系统，其特征在于：所述成像仪器包括飞秒激光器、非共线光学参量放大器和振镜组，所述飞秒激光器产生飞秒激光作为成像光束，成像光束经非共线光学参量放大器调制后入射到振镜组，成像光束经振镜组传输至所述多光子显微镜。
3.根据权利要求2所述的小脑中组织结构的无标记实时活体成像系统，其特征在于：所述成像仪器还包括连接到非共线光学参量放大器上的调制器，调制器产生电信号作为调制信号，调制信号用于控制非共线光学参量放大器对成像光束的激光参数进行调制，成像光束经过非共线光学参量放大器后的激光功率为700～1600mW，成像光束经过振镜组后的激光功率为5～20mW。
4.根据权利要求
5.根据权利要求1所述的小脑中组织结构的无标记实时活体成像系统，其特征在于：所述实时成像系统还包括主控电脑，所述主控电脑用于设置多光子显微镜的图像采集参数以及存储图像数据。
6.根据权利要求1所述的小脑中组织结构的无标记实时活体成像系统，其特征在于：所述的实验对象未注射荧光材料。
7.根据权利要求1所述的小脑中组织结构的无标记实时活体成像系统，其特征在于：所述小脑皮层的组织包括小脑皮层血管、神经细胞、神经纤维。
8.根据权利要求7所述的小脑中组织结构的无标记实时活体成像系统，其特征在于：所述小脑皮层血管包括分子层的大血管、从分子层垂直向下贯穿至颗粒层的血管、浦肯野层和颗粒层的血管；所述神经细胞包括小脑分子层的中间神经元、浦肯野层的浦肯野细胞、颗粒层的中间神经元；所述神经纤维包括小脑分子层中间神经元的轴突、浦肯野细胞的轴突、颗粒层的攀缘纤维和苔状纤维。
9.一种采用权利要求1-8任一所述的小脑中组织结构的无标记实时活体成像系统的实时成像方法，其特征在于：所述实时成像方法的具体步骤为：
10.根据权利要求9所述的实时成像方法，其特征在于：
...【技术特征摘要】
1.一种小脑中组织结构的无标记实时活体成像系统，其特征在于：所述实时活体成像系统用于获取实验对象目标成像区域内不同组织的结构图像，所述实时活体成像系统包括成像仪器和多光子显微镜，所述成像仪器产生飞秒激光作为成像光束传输至多光子显微镜，多光子显微镜将成像光束聚焦后入射到实验对象的目标成像区域，所述的目标成像区域为小脑皮层及白质层。
2.根据权利要求1所述的小脑中组织结构的无标记实时活体成像系统，其特征在于：所述成像仪器包括飞秒激光器、非共线光学参量放大器和振镜组，所述飞秒激光器产生飞秒激光作为成像光束，成像光束经非共线光学参量放大器调制后入射到振镜组，成像光束经振镜组传输至所述多光子显微镜。
3.根据权利要求2所述的小脑中组织结构的无标记实时活体成像系统，其特征在于：所述成像仪器还包括连接到非共线光学参量放大器上的调制器，调制器产生电信号作为调制信号，调制信号用于控制非共线光学参量放大器对成像光束的激光参数进行调制，成像光束经过非共线光学参量放大器后的激光功率为700～1600mw，成像光束经过振镜组后的激光功率为5～20mw。
4.根据权利要求1所述的小脑中组织结构的无标记实时活体成像系统，其特征在于：所述成像光束的飞秒激...
【专利技术属性】
技术研发人员：奚望，余媛，朱亮，付鹏，王梦琪，张鹤群，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：
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