一种制造技术

本发明专利技术公开了一种

【技术实现步骤摘要】
一种MHC区域三维基因组结构的高通量长读长测序方法


[0001]本专利技术涉及三维基因组研究领域，特别涉及一种
MHC
区域三维基因组结构的高通量长读长测序方法
。

技术介绍

[0002]主要组织相容性复合体（
Major
ꢁ
Histocompatibility
ꢁ
Complex,
ꢁ
MHC
）基因区域，位于人类6号染色体
6p21.3
区域，包含了一系列重要的免疫相关基因
。
在抗原呈递和免疫应答中发挥关键作用
。
然而
MHC
基因的精确表达调控机制还不明确，区域内基因间的三维空间组织可能影响其表达调控模式
。
此外，
MHC
区域高频率的基因重组也与三维结构相关
。
因此，解析
MHC
区域的三维染色质结构，对于理解其功能调控和进化机制意义重大
。
在临床转化方面，不同个体
MHC
等位基本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种
MHC
区域三维基因组结构的高通量长读长测序方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）细胞甲醛固定和交联：将细胞利用甲醛溶液进行交联固定，得到交联固定后的细胞；（2）细胞裂解和
DNA
片段连接：将步骤（1）中得到的交联固定后的细胞经裂解后，收集细胞核颗粒；然后利用限制性内切酶
DpnII
进行酶切反应，得到酶切产物；再将酶切产物利用
T4 DNA
连接酶进行连接，得到
DNA
连接产物；（3）混合酶解：
①
在步骤（2）得到的
DNA
连接产物中加入十二烷基硫酸钠溶液和蛋白酶
K
，然后在
56
～
63℃
孵育4～
12h
使染色质解交联，再加入
NaCl
溶液淬灭反应；待反应结束后加入由苯酚
、
氯仿和异戊醇组成的混合溶剂，混合均匀后加入
GlycoBlue
核酸共沉淀剂
、
醋酸钠溶液和异丙醇，在
‑
80
±
5℃
条件下孵育后离心
、
取沉淀，冰乙醇溶液清洗后用
EB
缓冲液重悬，得到
DNA
重悬液；
②
在步骤
①
得到的
DNA
重悬液中加入复合酶溶液，
30
～
37℃
孵育4～
12h
，然后加入由苯酚
、
氯仿和异戊醇组成的混合溶剂，混合均匀，再加入
GlycoBlue
核酸共沉淀剂
、
醋酸钠溶液和异丙醇，在
‑
80
±
5℃
条件下孵育后离心
、
取沉淀，冰乙醇溶液清洗后用
EB
缓冲液重悬，得到待测
DNA
样本；其中，复合酶为链霉蛋白酶
、
嗜热菌蛋白酶和胰蛋白酶；（4）
MHC
基因杂交捕获与
PCR
扩增：将步骤（3）
②
中得到的待测
DNA
样本使用
MHC
区域靶向探针进行杂交捕获，再进行
PCR
扩增，得到
PCR
产物；（5）
Pacbio HiFi CCS
文库构建和测序：将步骤（4）中得到的
PCR
产物构建
SMRTbell
文库并进行
PacBio
长片段测序
。2.
根据权利要求1所述的
MHC
区域三维基因组结构的高通量长读长测序方法，其特征在于：步骤
①
中所述的蛋白酶
K
的用量为按其在孵育体系的终浓度为
0.1
～
1mg/ml
添加计算；步骤
②
中所述的复合酶溶液中链霉蛋白酶
、
嗜热菌蛋白酶和胰蛋白酶的质量浓度比为2：1：
1。3.
根据权利要求2所述的
MHC
区域三维基因组结构的高通量长读长测序方法，其特征在于：步骤
①
中所述的蛋白酶
K
的用量为按其在孵育体系的终浓度为
1mg/ml
添加计算
。4.
根据权利要求1所述的
MHC
区域三维基因组结构的高通量长读长测序方法，其特征在于：步骤
①
中所述的十二烷基硫酸钠溶液的浓度为质量百分比
10%
；步骤
①
中所述的十二烷基硫酸钠溶液的用量为按其在孵育体系的终浓度为质量百分比
0.5
～
1%
添加计算；步骤
①
中所述的
NaCl
溶液的浓度为
5mol/L
；步骤
①
中所述的
NaCl
溶液的加入量为占孵育体系体积的5～
10%
；步骤
①
中所述的淬灭反应的条件为：在
68℃
下孵育2小时；
步骤
①
和
②
中所述的混合溶剂中的苯酚
、
氯仿和异戊的体积比
25
：
24
：1；步骤
①
和
②
中所述的
GlycoBlue
核酸共沉淀剂
、
醋酸钠溶液和异丙醇的体积比为
1:100:850
；步骤
①
和
②
中所述的醋酸钠溶液的浓度为
3mol/L
；步骤
①
中所述的异丙醇的加入量为占反应体系总体积的
75
～
85%
；步骤
①
中所述的在
‑
80
±
5℃
条件下孵育的时间为1小时；步骤
①
中所述的乙醇溶液为浓度为体积百分比
75%
；步骤
②
中所述的异丙醇的加入量为反应体系总体积的
40%
；步骤
①
和
②
中所述的离心的条件为：
4℃、17000g
离心
30
分钟
。5.
根据权利要求1所述的
MHC
区域三维基因组结构的高通量长读长测序方法，其特征在于：步骤（4）中所述的杂交的条件为：
95
ꢁ
℃
孵育
10
ꢁ
min
；步骤（4）中所述的捕获采用
Streptavidin
ꢁ
磁珠进行捕获；步骤（4）中所述的
PCR
扩增的反应体系为：
25
μ
L
ꢁ
2X
ꢁ
KAPA
ꢁ
HiFi
ꢁ
Hot
ꢁ
Start
ꢁ
Ready
ꢁ
Mix、2.5
μ
L
ꢁ
10
μ
M
ꢁ
Illumina
ꢁ
P5
ꢁ
...

【专利技术属性】
技术研发人员：迟玮，肖传乐，白鑫，钟嘉泳，胡苁，连韵钰，
申请(专利权)人：中山大学中山眼科中心，
类型：发明
国别省市：