一种针对一个或多个目标基因组区域进行边扩增边连接的方法技术

本发明专利技术涉及一种针对一个或多个目标基因组区域进行边扩增边连接的公用接头设计方法。本发明专利技术又涉及一种针对一个或多个目标基因组区域进行边扩增边连接的方法。本发明专利技术所述方法适用于针对任意长度的目标基因组区域的边扩增边连接工作，所得到的非特异连接的长链ＤＮＡ可根据研究需要应用于多种ＤＮＡ分析平台。本发明专利技术还涉及一种针对一个或多个目标基因组区域序列重测序工作、建立随机ＤＮＡ文库的方法，所得随机ＤＮＡ文库可用于通过包括Ｓａｎｇｅｒ测序技术、边合成边测序技术在内的测序方法对所述一个或多个目标基因组区域序列进行重测序。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种针对一个或多个目标基因组区域进行边扩增边连接的公用接头 设计方法。本专利技术又涉及。 本专利技术所述方法适用于针对任意长度的目标基因组区域的边扩增边连接工作，所得到的非 特异连接的长链DNA可根据研究需要应用于多种DNA分析平台。本专利技术还涉及一种针对一 个或多个目标基因组区域序列重测序工作、建立随机DNA文库的方法，所得随机DNA文库可 用于通过包括Sanger测序技术、边合成边测序技术在内的测序方法对所述一个或多个目 标基因组区域序列进行重测序。
技术介绍
自 1983 年 Kary Mullis 专利技术聚合酶链式反应(polymerase chainreaction,PCR) 以来，历经三十多年，PCR技术已成为生物科学领域不可或缺的、运用广泛的实验技术。为 不同的实验目的，在标准PCR基础上又衍生出RT-PCR(Reverse Transcriptase PCR，逆转 录 PCR)、Inverse PCR(反向 PCR)，In Situ PCR(原位 PCR)，Long PCR(长 PCR)，Real Time PCR(实时 PCR)，Single Cell PCR(单细胞 PCR)，Hot Start PCR(热启动 PCR)，Colony PCR(菌落 PCR)，AFLPPCR(Amplified Fragment Length Polymorphism PCR，扩增片断长度 多态性PCR)等多项技术手段。可以说，自PCR技术问世以来，分子生物学及之后的基于大 规模测序反应的基因组学均得到了飞速的发展。本专利技术应用碱基互补配对的基本原理，通过设计含“公用接头”的目标基因组区域 的引物，在第一轮多核苷酸扩增反应后，第二轮多核苷酸扩增反应中，将目标基因组区域在 扩增的基础上进行高效地连接，即“边扩增边连接”。连接工作按随机顺序进行，在本专利技术的 上下文中这种随机顺序连接的方式称为“非特异连接”。经过边扩增边连接得到由目标基因 组区域的DNA片段经“非特异连接”而成的长链DNA，此长链DNA可根据研究需要应用于多 种DNA分析平台。通过本专利技术提出的“边扩增边连接”方法获得长链DNA，并经过DNA随机打断法打 断，可建立用于通过包括Sanger测序技术、边合成边测序技术在内的测序方法对所述一个 或多个目标基因组区域序列进行重测序工作的随机DNA文库。本专利技术可运用于一个目标基因组区域的边扩增边连接和随机DNA文库建立工作， 也可用于两个及两个以上的多个目标基因组区域边扩增边连接和随机DNA文库建立工作。设计目的的不同，使本专利技术提出的“边扩增边连接”反应与同样使用接头设计的串 联PCR方法具有本质的分别串联PCR是根据具体研究的需要，进行特殊的接头设计，将本 属基因组不同区域的DNA，甚至是不同物种基因组的DNA片断进行“特异性”连接，以获得研究所需要的“功能性DNA片段”。而本专利技术是为了得到特异扩增的、“非特异连接”的长链 DNA。在本专利技术中，除在目标基因组区域的引物设计中在正向引物和反向引物的5’端和 3’端分别加上本专利技术提出的一对反向互补的公用接头外，两轮多核苷酸扩增反应均无需特 殊处理；非特异连接长链DNA的生成无需“连接酶”作用。本专利技术获得的长链DNA可突破在保真要求限制下的长PCR(LongPCR)方法目的片段长度的限制，而且可免去使用包含特殊酶物质的试剂盒及设计更严格引物的麻烦；与使 用同连接区域特异配对之接头的串联PCR(0Verlap PCR)方法相比，本专利技术只需设计一对公 用接头，在第二轮多核苷酸扩增反应中利用公用接头将目标基因组区域原始DNA片段按随 机顺序连接，又免去了设计多对可用于特异串联的互补引物的工序，对本行业的技术人员 来说本专利技术所涉及的实验室工作是简单易行且费用很低的。
技术实现思路
本专利技术基于以下认识在目标基因组区域的每对引物设计中加入反向互补的同一 对“公用接头”(Universal Adaptor)，对目标基因组区域的原始DNA片断进行特异性多核 苷酸扩增和非酶法连接，形成由目标基因组区域DNA片段按随机顺序连接而成的长链DNA 混合物。本专利技术获得的长链DNA可在诸多DNA分析平台上进行应用，对高通量重测序工作 尤其具有重要的意义。在经过诸如超声法、喷雾法、化学剪切法、酶剪切法等在内的DNA随 机打断法打断后，可重新获得含有目标基因组区域片段的DNA片段，这些DNA片段可高效地 涵盖整个目标区域，将其作为重测序工作的随机DNA文库(DNA library)，可有效地进行目 标基因组区域的高通量重测序工作。本专利技术的一个方面，涉及一种用于针对一个或多个目标基因组区域进行边扩增边 连接的公用接头，其为两条以5’ 一 3’方向和以3’ 一 5’方向碱基互补的寡核苷酸序列，其 序列结构特征为1)在多核苷酸扩增反应退火温度下不与目标基因组结合；2)自身不形成 发夹等二级结构；3)胞嘧啶和鸟嘌呤的含量占四种碱基数量总和的20% -80%;且4)序列 长度在7-100个碱基。具体的，所述一对公用接头中的一个加在多核苷酸扩增反应正向引 物的5’端，与之互补的另一个加在多核苷酸扩增反应反向引物的5’端。本专利技术中，为满足加在引物两端而不影响对目标基因组区域进行扩增，同时为降 低成本的要求，所述公用接头的长度应当尽可能选择较短的寡核苷酸序列，其长度适当地 为8-50个碱基，优选为9-40个碱基，更优选为10-30个碱基，更优选为11_25个碱基，更优 选为12-20个碱基，更优选为13-18个碱基，甚至更优选为17个碱基。本专利技术又一方面，涉及一种针对一个目标基因组区域进行边扩增边连接的方法， 包括步骤1)针对一个目标基因组区域，设计包含本专利技术所述公用接头的用于多核苷酸扩增 反应的正向和反向引物，其中正向和反向引物中公用接头彼此反向互补；2)利用步骤1)中所述正向和反向引物，通过第一轮多核苷酸扩增反应，扩增目标 基因组区域，得到在所述目标基因组区域5’端和3’端加入本专利技术所述公用接头的可连接 性DNA片段；3)步骤2)获得的可连接性DNA片段，作为第二轮多核苷酸扩增反应的模板进行边 扩增边连接反应；得到由步骤2)所得可连接性DNA片段连接而成的长链DNA。在本专利技术中，所述目标基因组序列区域可以为任意长度的目标基因组区域，包括 但不限于长度在70-10000个碱基的序列，例如，长度在100-3000个碱基的序列，长度在 300-2000个碱基的序列，长度在700-1000个碱基的序列。在本专利技术的又一方面，涉及一种针对两个及两个以上的多个目标基因组区域进行 边扩增边连接的方法，包括步骤1)针对多个目标基因组区域的每个区域，分别设计包含本专利技术所述公用接头的用 于多核苷酸扩增反应的正向和反向引物，其中每对正向和反向引物所含公用接头彼此反向 互补；2)利用步骤1)中所述正向和反向引物，通过第一轮多核苷酸扩增反应，分别扩增 目标基因组区域，得到在各个目标基因组区域5’端和3’端加入本专利技术所述公用接头的不 同可连接性DNA片段；3)将步骤2)获得的不同可连接性DNA片段进行等量地混合，作为第二轮多核苷酸 扩增反应的模板进行边扩增边连接反应；得到由步骤2)所得不同的可连接性DNA片段按随 机连本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种对一个和多个目标基因组区域进行边扩增边连接的公用接头，其包括两条以５’→３’方向和以３’→５’方向碱基互补的寡核苷酸序列，所述寡核苷酸序列的结构特征为：１）在多核苷酸扩增和连接退火温度下不与目标基因组结合；２）自身不形成发夹等二级结构；３）胞嘧啶和鸟嘌呤的含量占四种碱基数量总和的２０％－８０％；且４）序列长度在７－１００碱基，所述碱基互补的寡核苷酸序列为ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ和ＡＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张秀清，苏夜阳，林琳，汪建，杨焕明，
申请(专利权)人：北京华大基因研究中心，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]