一种基于事件引导的高靶向性荧光相关光谱方法及其装置制造方法及图纸

本发明专利技术提供一种基于事件引导的高靶向性荧光相关光谱方法及其装置

【技术实现步骤摘要】
一种基于事件引导的高靶向性荧光相关光谱方法及其装置


[0001]本专利技术涉及光学显微领域，尤其涉及一种基于事件引导的高靶向性荧光相关光谱方法及其装置
。

技术介绍

[0002]生物系统中的分子动力学是生命事件的基础，荧光相关光谱是一种通过分析生物分子在聚焦的观测体积中扩散时发出的强度波动来检测其分子动力学的强大工具，
FCS
可以精确地测量分子的局部浓度
、
流体力学半径
、
扩散系数以及不同生物分子的相互作用等，与其他面向动力学的方法相比，
FCS
具有更宽的可测量事件范围，从
ns
到
s
，以及更高的灵敏度，可以达到单分子水平，共焦显微镜提供了非常有限的观察体积
(
约
0.5f l)
，这显著提高了
FCS
的信噪比
。
[0003]在研究活体生物系统的各种动态过程时，
FCS
不可避免地会受到许多因素的影响，如细胞的运动
、
荧光团的光漂白
、
亚衍射区的异常动态等，为了克服这些困难，在过去二十年中已经开展了许多工作，以扩展
FCS
的能力，例如，双色
FCCS
被提出用于测量不同分子的相互作用，空间复用技术允许
FCS
探测不同位置的动态过程，对于静态
FCS
，观测体积被固定在样品中的特定位置，因此不适用于生物膜中较慢的扩散动力学研究，在这种情况下，荧光团在焦点光斑中出现的频率较低，给采样带来了问题，为了得到足够的采集数据往往需要很长的采集时间，而焦点体积的长时间滞留增加了光破坏的可能性，扫描
FCS
通过快速扫描过样品，计算与一个或多个位置相关联的组合强度轨迹的自相关性，然后应用拟合模型获得动力学信息，平行扫描
FCS
在膜平面上沿一条线
、
两条线或一个圆扫描聚焦光，获取并组装具有时间和像素信息的光子，然后从扫描的线或圆中提取每个像素的强度并将其分箱成图像强度轨迹，图像强度轨迹的自相关可以提供目标生物分子的浓度和扩散系数等信息，同时，距离已知的两条扫描线或扫描圆的两个像素的强度也可以自相关和互相关，对得到的自相关和互相关关系进行全局拟合，可以得到被测生物分子的大小
、
浓度
、
扩散系数等信息，扫描
FCS
对一部分样品进行重复采样可确保减少荧光团的光漂白，并提高统计准确性，有助于检查活细胞应用中的动态行为和浓度
。
[0004]无论是单点
FCS
还是扫描
FCS
对事件进行检测，都需要人为的选择感兴趣区域然后进行数据采集，对感兴趣区域的选择会很大程度的影响实验结果，不好的感兴趣区域会导致采集的数据少，甚至可能探测不到该事件的信号信息，感兴趣区域的选择的问题在大背景的活细胞内更为明显，而感兴趣区域的选择往往依靠实验人员的经验，这让实验的效率低下
。
[0005]因此，有必要提供一种基于事件引导的高靶向性荧光相关光谱方法及其装置解决上述技术问题
。

技术实现思路

[0006]本专利技术提供一种基于事件引导的高靶向性荧光相关光谱方法及其装置，解决了上
述技术背景的问题
。
[0007]为解决上述技术问题，本专利技术提供的一种基于事件引导的高靶向性荧光相关光谱方法，包括以下步骤：
[0008]S1、
宽场模块中光源产生激发光照射在样品上收集信号，实现快速宽场成像；
[0009]S2、
将得到的宽场图像通过针对事件类型专门设计的动态事件判别模块进行实时处理，该模块返回任何检测到的事件的一组坐标，如果检测到一个事件，则停止宽场成像，并在具有预先确定的采集参数的检测坐标周围开始
FCS
采集；
[0010]S3、FCS
模块进行
FCS
数据采集；
[0011]S4、
获得
FCS
数据时，就可以保存有关事件的全面数据，包括导致检测到的事件的宽视场时间间隔
、
扫描的数据，以及总结事件检测和扫描的参数和计时的日志文件，在采集后的分析中，保存的辅助数据用于确认事件的有效性，以及对每个事件的
FCS
分析进行辅助；
[0012]S5、
然后显微镜返回到先前的设置，另一个连续的宽视场记录立即开始，该方法可以无限运行，并且由焦点锁定模块保持整个实验过程中样品的稳定，防止轴向漂移
。
[0013]进一步地，步骤
S1
中宽场模块内激光器输出第一束激光，经高数值孔径物镜聚焦到荧光材料，通过电子自发辐射跃迁发射荧光，荧光材料发射的信号，经过高数值孔径物镜收集，通过滤波系统筛选出荧光信号，由
CCD
进行探测，获得宽场图像
。
[0014]进一步地，在步骤
S2
中在显微镜控制软件实现的控制部件中进行实时事件分析
、
坐标变换和实时视觉反馈；
[0015]在宽场空间和扫描空间之间使用三阶多项式坐标变换来实现整个视场内的精确坐标变换；
[0016]该变换通过检测荧光珠在两种成像模式和多项式变换中的系数拟合进行校准，通过将所有被检测珠子的宽视场坐标变换到扫描空间，并与扫描图像中被检测珠子的宽视场坐标进行比较；
[0017]宽场和
FCS
间的转化发生在事件发生后的几十毫秒的时间窗口内以及实时对事件进行记录；
[0018]事件触发的模式转换通过八个主要步骤进行工作：
[0019]1、
初始化事件触发方法；
2、
记录快速成像图像；
3、
运行动态事件判别模块；
4、
若检测到坐标：继续；若未检测到坐标：从步骤2开始重复；
5、
将检测坐标转化为扫描空间；6准备扫描并计算扫描曲线；
7、
运行扫描；
8、
保存数据和日志文件；
[0020]最后可以选择在无限循环中重复步骤2‑8，以获得许多事件的全自动获取；
[0021]在步骤8中保存的最终数据不仅包括
FCS
记录数据，还包括导致事件的快速成像帧堆栈，以及包含例如触发事件坐标
、
转化坐标
、
事件判别模块参数和过程中不同步骤期间的时间戳的日志文件
。
[0022]进一步地，在步骤
S3
中，激光器输出第二束激光，作为
FCS
模块的激发光，通过滤波模块后，经过高数值孔径的物镜聚焦到荧光材料，通过电子自发辐射跃迁发射荧光，荧光材料发射的信号，经过物镜收集，通过滤光片筛选出荧光信号，通过针孔，由雪崩光电二极管进行探测，获得焦点处本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种基于事件引导的高靶向性荧光相关光谱方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、
宽场模块中光源产生激发光照射在样品上收集信号，实现快速宽场成像；
S2、
将得到的宽场图像通过针对事件类型专门设计的动态事件判别模块进行实时处理，该模块返回任何检测到的事件的一组坐标，如果检测到一个事件，则停止宽场成像，并在具有预先确定的采集参数的检测坐标周围开始
FCS
采集；
S3、FCS
模块进行
FCS
数据采集；
S4、
获得
FCS
数据时，就可以保存有关事件的全面数据，包括导致检测到的事件的宽视场时间间隔
、
扫描的数据，以及总结事件检测和扫描的参数和计时的日志文件，在采集后的分析中，保存的辅助数据用于确认事件的有效性，以及对每个事件的
FCS
分析进行辅助；
S5、
然后显微镜返回到先前的设置，另一个连续的宽视场记录立即开始，该方法可以无限运行，并且由焦点锁定模块保持整个实验过程中样品的稳定，防止轴向漂移
。2.
根据权利要求书1所述的一种基于事件引导的高靶向性荧光相关光谱方法，其特征在于，步骤
S1
中宽场模块内激光器输出第一束激光，经高数值孔径物镜
(41)
聚焦到荧光材料，通过电子自发辐射跃迁发射荧光，荧光材料发射的信号，经过高数值孔径物镜
(41)
收集，通过滤波系统筛选出荧光信号，由
CCD
进行探测，获得宽场图像
。3.
根据权利要求书2所述的一种基于事件引导的高靶向性荧光相关光谱方法，其特征在于，在步骤
S2
中在显微镜控制软件实现的控制部件中进行实时事件分析
、
坐标变换和实时视觉反馈；在宽场空间和扫描空间之间使用三阶多项式坐标变换来实现整个视场内的精确坐标变换；该变换通过检测荧光珠在两种成像模式和多项式变换中的系数拟合进行校准，通过将所有被检测珠子的宽视场坐标变换到扫描空间，并与扫描图像中被检测珠子的宽视场坐标进行比较；宽场和
FCS
间的转化发生在事件发生后的几十毫秒的时间窗口内以及实时对事件进行记录；事件触发的模式转换通过八个主要步骤进行工作：
1、
初始化事件触发方法；
2、
记录快速成像图像；
3、
运行动态事件判别模块；
4、
若检测到坐标：继续；若未检测到坐标：从步骤2开始重复；
5、
将检测坐标转化为扫描空间；6准备扫描并计算扫描曲线；
7、
运行扫描；
8、
保存数据和日志文件；最后可以选择在无限循环中重复步骤2‑8，以获得许多事件的全自动获取；在步骤8中保存的最终数据不仅包括
FCS
记录数据，还包括导致事件的快速成像帧堆栈，以及包含例如触发事件坐标
、
转化坐标
、
事件判别模块参数和过程中不同步骤期间的时间戳的日志文件
。4.
根据权利要求书3所述的一种基于事件引导的高靶向性荧光相关光谱方法，其特征在于，在步骤
S3
中，激光器输出第二束激光，作为
FCS
模块的激发光，通过滤波模块后，经过高数值孔径的物镜聚焦到荧光材料，通过电子自发辐射跃迁发射荧光，荧光材料发射的信号，经过物镜收集，通过滤光片筛选出荧光信号，通过针孔，由雪崩光电二极管
(28)
进行探测，获得焦点处的荧光强度信号，记录荧光时间轨迹
。5.
根据权利要求书4所述的一种基于事件引导的高靶向性荧光相关光谱方法，其特征
在于，在步骤
S4
中对事件有效性的确认需要基于
FCS
信号以及导致事件的
N
个宽场帧以及描述触发事件
(
坐标，计时等
)
的日志文件；这些帧用于采集后分析，以确定触发事件实际上是真实的目标事件还是由其他因素引起的；为了对事件进行分类，可以研究事件前的
N
个宽视场帧，通过使用日志文件中保存的触发坐标可以提取触发坐标周围的信号轨迹，通常真实事件会在最后一帧表现出显著的增加，而由于帧中某些东西快速移动到检测像素而导致的假事件将显示出相对平坦的响应
。6.
根据权利要求书5所述的一种基于事件引导的高靶...

【专利技术属性】
技术研发人员：詹求强，皮彭健，蒲锐，弓晟，王玉琦，陈智睿，
申请(专利权)人：华南师范大学，
类型：发明
国别省市：