包含具有相行为的蛋白的融合蛋白制造技术

本文提供了包含第一多肽和第二多肽的融合蛋白，其中该第二多肽具有相行为

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包含具有相行为的蛋白的融合蛋白
相关申请的交叉引用
[0001]本申请要求
2021
年2月
19
日提交的美国临时申请号
63/151,524
的优先权，出于所有目的，该临时申请通过引用以其全文并入本文
。
电子提交的文本文件的说明
[0002]电子提交的文本文件的内容通过引用以其全文并入本文：序列表的计算机可读格式副本
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文件名：
ISOL_006_00US_SeqList_ST25.txt
，记录日期：
2021
年2月
19
日；文件大小：1兆字节
)。


[0003]本披露总体上涉及用于纯化生物制品的组合物和方法
。
更具体地，本披露涉及包含腺相关病毒结合多肽的纯化基质及其使用方法
。

技术介绍

[0004]生物制剂在医学和其他学科中的使用正在迅速增加
。
生物制剂通常对给定靶标具有高亲和力和特异性，以及低毒性和生物降解性
。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.
一种用于稳定第一多肽的方法，所述方法包括表达包含所述第一多肽和第二多肽的融合蛋白，其中所述第二多肽是具有相行为的多肽，其中当所述融合蛋白暴露于一个或多个会使所述第一多肽不稳定的条件下时，所述第一多肽基本上保持其活性
。2.
一种基本上防止第一多肽在暴露于一个或多个使所述第一多肽解折叠
、
降解和
/
或错误折叠的条件后活性损失的方法，所述方法包括表达包含所述第一多肽和第二多肽的融合蛋白，其中所述第二多肽是具有相行为的多肽
。3.
一种基本上防止第一多肽解折叠
、
降解和
/
或错误折叠的方法，所述方法包括表达包含所述第一多肽和第二多肽的融合蛋白，其中所述第二多肽是具有相行为的多肽，其中当所述融合蛋白暴露于一个或多个会导致解折叠
、
降解和
/
或错误折叠的条件下时
。4.
一种改善第一多肽的产率的方法，所述方法包括：
i)
表达融合蛋白，其包含所述第一多肽和具有相行为的第二多肽；以及
ii)
将所述第一多肽与所述第二多肽分离，其中与不表达为融合蛋白时所述第一多肽的产率相比，表达为所述融合蛋白时所述第一多肽的产率改善
。5.
如权利要求1‑3中任一项所述的方法，其包括从所述条件去除所述融合蛋白并将所述第一多肽从所述第二多肽切割，其中所述第一多肽与尚未暴露于所述条件的对照第一多肽相比保留其活性
。6.
如权利要求
1、2
或5中任一项所述的方法，其中使所述第一多肽解折叠
、
降解
、
错误折叠或不稳定的一个或多个条件包括：暴露于氧化剂
、
冻干
、
暴露于非生理
pH、
暴露于离液剂
、
暴露于至少
50℃
的温度
、
暴露于有机溶剂
、
暴露于脲
、
暴露于洗涤剂
、
暴露于高压灭菌
、
冻融循环
、
热休克或其组合
。7.
如权利要求
1、2、5
或6中任一项所述的方法，其中使所述第一多肽解折叠
、
降解
、
错误折叠或不稳定的一个或多个条件包括：暴露于非生理
pH。8.
如权利要求7所述的方法，其中暴露于非生理
pH
是暴露于酸
。9.
如权利要求8所述的方法，其中所述酸是盐酸胍
。10.
如权利要求7所述的方法，其中暴露于非生理
pH
是暴露于碱
。11.
如权利要求
10
所述的方法，其中所述碱是氢氧化钠或脲
。12.
如权利要求6所述的方法，其中已知使所述第一多肽解折叠
、
降解
、
错误折叠或不稳定的一个或多个条件是暴露于盐酸胍
、
暴露于脲
、
冻干
、
冻融循环
、
高压灭菌
、
暴露于氢氧化钠或暴露于至少
90℃
的温度
。13.
如权利要求
1、2、5
或6中任一项所述的方法，其中已知使所述第一多肽解折叠
、
降解
、
错误折叠或不稳定的一个或多个条件是暴露于
0.1M NaOH。14.
如权利要求
1、2、5、6
或
13
中任一项所述的方法，其中已知使所述第一多肽解折叠
、
降解
、
错误折叠或不稳定的一个或多个条件是暴露于
0.1M NaOH 30
分钟
。15.
如权利要求
1、2、5
或6中任一项所述的方法，其中已知使所述第一多肽解折叠
、
降解或不稳定的一个或多个条件是暴露于
6M
盐酸胍
。16.
如权利要求
1、2、5、
或
6、
或
15
中任一项所述的方法，其中已知使所述第一多肽解折叠
、
降解
、
错误折叠或不稳定的一个或多个条件是暴露于
6M
盐酸胍
30
分钟
。17.
如权利要求
1、2、5
或6中任一项所述的方法，其中已知使所述第一多肽解折叠
、
降
解
、
错误折叠或不稳定的一个或多个条件是加热至至少
95℃。18.
如权利要求
1、2、5
或6中任一项所述的方法，其中所述条件是热休克，并且其中热休克包括：将包含所述第一多肽的所述融合蛋白加热至
95℃ 30
分钟；将含有所述融合蛋白的容器置于冰上，然后将所述融合蛋白恢复至室温
。19.
如权利要求
1、2
或5‑
18
中任一项所述的方法，其中将包含所述第一多肽的所述融合蛋白暴露于所述一个或多个条件约
15
分钟
、
约
30
分钟
、
约
45
分钟
、
约1小时
、
约2小时
、
约3小时
、
约4小时
、
约5小时
、
约6小时
、
约7小时
、
约8小时
、
约9小时
、
约
10
小时
、
约
11
小时
、
约
12
小时
、
约
13
小时
、
约
14
小时
、
约
15
小时
、
约
16
小时
、
约
17
小时
、
约
18
小时
、
约
19
小时
、
约
20
小时
、
约
21
小时
、
约
22
小时
、
约
23
小时或约
24
小时
。20.
如权利要求
1、2
或5‑
18
中任一项所述的方法，其中暴露于所述一个或多个条件持续至少约
30
分钟
。21.
如权利要求
1、2、6
‑
10、13、15
或
17
中任一项所述的方法，其中暴露于所述一个或多个条件持续约
30
分钟至约
12
小时
、
约
30
分钟至约
11
小时
、
约
30
分钟至约
10
小时
、
约
30
分钟至约9小时
、
约
30
分钟至约8小时
、
约
30
分钟至约7小时
、
约
30
分钟至约6小时
、
约
30
分钟至约5小时
、
约
30
分钟至约4小时
、
约
30
分钟至约3小时
、
约
30
分钟至约2小时或约
30
分钟至约1小时
。22.
如权利要求
1、2
或5‑
21
中任一项所述的方法，其中所述第一多肽的活性是其对所述第一多肽的结合配偶体的亲和力
。23.
如权利要求
1、2
或5‑
21
中任一项所述的方法，其中所述第一多肽是酶，并且其中所述活性是
k
cat
。24.
如权利要求
1、2
或5‑
23
中任一项所述的方法，其中与对照相比，所述第一多肽在暴露于所述条件中的一个或多个后活性损失少于
35
％
、
少于
30
％
、
少于
25
％
、
少于
20
％
、
少于
15
％
、
少于
10
％
、
少于5％
、
少于3％
、
少于2％或少于1％，其中所述对照未暴露于已知使所述第一多肽解折叠
、
降解或不稳定的条件
。25.
如权利要求
1、2
或5‑
24
中任一项所述的方法，其中与对照相比，所述第一多肽在暴露于所述条件中的一个或多个后保留其活性的
65
％至
100
％
。26.
如权利要求
25
所述的方法，其中与对照相比，所述第一多肽在暴露于所述条件中的一个或多个后保留其活性的至少
65
％
、
至少
70
％
、
至少
75
％
、
至少
80
％
、
至少
85
％
、
至少
90
％
、
至少
95
％或
100
％
。27.
如权利要求
24
所述的方法，其中与对照相比，所述第一多肽在暴露于所述条件中的一个或多个后活性损失少于
20
％或少于
25
％，其中所述对照未暴露于已知使所述第一多肽解折叠
、
降解或不稳定的条件
。28.
如权利要求
25
所述的方法，其中与对照相比，所述第一多肽在暴露于所述条件中的一个或多个后保留其活性的至少
80
％
。29.
如权利要求
1、2
或5‑
28
中任一项所述的方法，其中所述第一多肽在
4℃
保留其活性约1周
、
约2周
、
约3周
、
约4周
、
约5周
、
约6周
、
约7周
、
约8周
、
约9周
、
约
10
周
、
约
11
周
、
约
12
周
、
约1个月
、
约2个月
、
约3个月
、
约4个月
、
约5个月
、
约6个月
、
约7个月
、
约8个月
、
约9个月
、
约
10
个月
、
约
11
个月或约
12
个月
。
30.
如权利要求
1、2
或5‑
28
中任一项所述的方法，其中所述第一多肽在
‑
20℃
保持其活性约6个月
、
约9个月
、
约1年
、
约2年
、
约3年
、
约4年
、
约5年
、
约6年
、
约7年
、
约8年
、
约9年或约
10
年
。31.
如权利要求4所述的方法，其中所述第一多肽的产率大于
15mg/
升
、
大于
30mg/
升
、
大于
50mg/
升
、
大于
75mg/
升
、
大于
100mg/
升
、
大于
200mg/
升或大于
300mg/
升宿主细胞悬浮液
。32.
如权利要求4所述的方法，其中所述融合蛋白中所述第一多肽的产率比不作为融合蛋白表达的第一多肽的产率高至少约
50
％
、
至少约
75
％
、
至少约
100
％
、
至少约
125
％
、
至少约
150
％
、
至少约
175
％
、
至少约
200
％
、
至少约
225
％
、
至少约
250
％
、
至少约
275
％
、
至少约
300
％
、
至少约
325
％
、
至少约
350
％
、
至少约
375
％
、
至少约
400
％
、
至少约
425
％
、
至少约
450
％
、
至少约
475
％
、
至少约
500
％
、
至少约
525
％
、
至少约
550
％
、
至少约
575
％
、
至少约
600
％
、
至少约
625
％
、
至少约
650
％
、
至少约
675
％
、
至少约
700
％
、
至少约
725
％
、
至少约
750
％
、
至少约
775
％
、
至少约
800
％
、
至少约
825
％
、
至少约
850
％
、
至少约
875
％
、
至少约
900
％
、
至少约
925
％
、
至少约
950
％
、
至少约
975
％
、
至少约
1000
％
、
至少约
1100
％
、
至少约
1125
％
、
至少约
1150
％
、
至少约
1175
％
、
至少约
1200
％
、
至少约
1225
％
、
至少约
1250
％
、
至少约
1275
％
、
至少约
1300
％
、
至少约
1325
％
、
至少约
1350
％
、
至少约
1375
％
、
至少约
1400
％
、
至少约
1425
％
、
至少约
1450
％
、
至少约
1475
％
、
至少约
1500
％
、
至少约
1525
％
、
至少约
1550
％
、
至少约
1575
％
、
至少约
1600
％
、
至少约
1625
％
、
至少约
1650
％
、
至少约
1675
％
、
至少约
1700
％
、
至少约
1725
％
、
至少约
1750
％
、
至少约
1775
％
、
至少约
1800
％
、
至少约
1825
％
、
至少约
1850
％
、
至少约
1875
％
、
至少约
1900
％
、
至少约
1925
％
、
至少约
1950
％
、
至少约
1975
％或至少约
2000
％
。33.
如权利要求4所述的方法，其中所述第一多肽的产率大于
75mg/
升
。34.
如权利要求4所述的方法，其中所述第一多肽的产率比不表达为融合蛋白的第一多肽的产率高约
300
％
。35.
如权利要求1‑
34
中任一项所述的方法，其中所述融合蛋白在选自哺乳动物细胞
、
细菌细胞
、
真菌细胞
、
酵母细胞和植物细胞的宿主细胞中表达
。36.
如权利要求1‑
35
中任一项所述的方法，其中所述第一多肽是：
i)
酶或其催化片段；
ii)
抗体或其抗原结合片段；
iii)
信号传导分子或其片段；
iv)
结构蛋白或其片段；
v)
激素或其片段或衍生物；
vi)
核酸结合蛋白或其片段或衍生物；
vii)
治疗剂或其片段；
viii)
载剂蛋白或其片段；
ix)
细胞因子或其片段；或者
x)
毒素或其片段
。37.
如权利要求1‑
36
中任一项所述的方法，其中所述第一多肽是哺乳动物多肽
。38.
如权利要求1‑
36
中任一项所述的方法，其中所述第一多肽是病毒多肽
。39.
如权利要求1‑
36
中任一项所述的方法，其中所述第一多肽是细菌多肽
。
40.
如权利要求1‑
36
中任一项所述的方法，其中所述第一多肽是毒素
。41.
如权利要求1‑
36
中任一项所述的方法，其中所述第一多肽是抗原性多肽
。42.
如权利要求1‑
41
中任一项所述的方法，其中所述第一多肽是能够执行蛋白质合成或修饰中涉及的一个或多个步骤的酶
。43.
如权利要求1‑
41
中任一项所述的方法，其中所述第一多肽是能够执行
DNA
合成或修饰中涉及的一个或多个步骤的酶
。44.
如权利要求1‑
41
中任一项所述的方法，其中所述第一多肽是能够执行
RNA
合成或修饰中涉及的一个或多个步骤的酶
。45.
如权利要求1‑
41
中任一项所述的方法，其中所述第一多肽选自分化簇
4(CD4)、
葡萄球菌蛋白
A
的
Z
结构域
(SpA Z
结构域
)、
低密度脂蛋白受体
(LDLR)、
白蛋白结合多肽
(ABD)、
柯萨奇病毒和腺病毒受体
(CAR)、
纤连蛋白
III
型
(FN3)、
聚
(A)
结合蛋白
(PABP)、Z
‑
DNA
结合蛋白
1(ZBP1)
或其片段或衍生物
。46.
如权利要求1‑
41
中任一项所述的方法，其中所述第一多肽是分离自或衍生自
SARS
‑
CoV
‑2的多肽
。47.
如权利要求
46
所述的方法，其中所述第一多肽是
SARS
‑
CoV
‑2刺突蛋白或其片段或衍生物
。48.
如权利要求1‑
47
中任一项所述的方法，其中所述具有相行为的第一多肽是弹性蛋白样多肽
(ELP)
或节肢弹性蛋白样多肽
(RLP)。49.
如权利要求1‑
47
中任一项所述的方法，其中所述具有相行为的多肽包含具有序列
(Val
‑
Pro
‑
Gly
‑
Xaa
‑
Gly)
n
(SEQ ID NO:10)
的五肽重复，或其随机的
、
乱序的类似物；其中
Xaa
可以是除脯氨酸之外的任何氨基酸，其中
n
是1与
360
之间的整数，包括端点
。50.
如权利要求1‑
48
中任一项所述的方法，其中所述具有相行为的多肽包含选自以下的氨基酸序列：
a.(GRGDSPY)
n
(SEQ ID NO:1)b.(GRGDSPH)
n
(SEQ ID NO:2)c.(GRGDSPV)
n
(SEQ ID NO:3)d.(GRGDSPYG)
n
(SEQ ID NO:4)e.(RPLGYDS)
n
(SEQ ID NO:5)f.(RPAGYDS)
n
(SEQ ID NO:6)g.(GRGDSYP)
n
(SEQ ID NO:7)h.(GRGDSPYQ)
n
(SEQ ID NO:8)i.(GRGNSPYG)
n
(SEQ ID NO:9)j.(GVGVP)
n
(SEQ ID NO:11)
；
k.(GVGVPGLGVPGVGVPGLGVPGVGVP)
m
(SEQ ID NO:12)
；
l.(GVGVPGVGVPGAGVPGVGVPGVGVP)
m
(SEQ ID NO:13)
；
m.(GVGVPGWGVPGVGVPGWGVPGVGVP)
m
(SEQ ID NO:14)
；
n.(GVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGEGVPGFGVPGVGVP)
m
(SEQ ID NO:15)
；
o.
(GVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGKGVPGFGVPGVGVP)
m
(SEQ ID NO:16)
；以及
p.(GAGVPGVGVPGAGVPGVGVPGAGVP)
m
(SEQ ID NO:17)
；或其随机的
、
乱序的类似物；其中：
n
是
20
‑
360
范围内的整数，包括端点；并且
m
是4‑
25
范围内的整数，包括端点
。51.
如权利要求1‑
48
中任一项所述的方法，其中所述具有相行为的多肽包含选自以下的氨基酸序列：
(GVGVP)
m
(SEQ ID NO:143)
；
(ZZPXXXXGZ)
m
(SEQ ID NO:148)
；
(ZZPXGZ)
m
(SEQ ID NO:149)
；
(ZZPXXGZ)
m
(SEQ ID NO:150)
；或者
(ZZPXXXGZ)
m
(SEQ ID NO:151)
，其中
m
是
10
与
160
之间的整数，包括端点，其中
X
如果存在的话是除脯氨酸或甘氨酸之外的任何氨基酸，并且其中
Z
如果存在的话是任何氨基酸
。52.
如权利要求1‑
48
中任一项所述的方法，其中所述具有相行为的多肽包含选自以下的氨基酸序列：
(a)(GVGVPGVGVPGAGVPGVGVPGVGVP)
m
(SEQ ID NO:144)
；或者
(b)(GVGVPGVGVPGLGVPGVGVPGVGVP)
m
(SEQ ID NO:146)
；其中
m
是2与
32
之间的整数，包括端点
。53.
如权利要求1‑
48
中任一项所述的方法，其中所述具有相行为的多肽包含选自以下的氨基酸序列：
(a)(GVGVPGVGVPGAGVPGVGVPGVGVP)
m
(SEQ ID NO:144)
，其中
m
是8或
16
；
(b)(GVGVPGAGVP)
m
(SEQ ID NO:145)
，其中
m
是5与
80
之间的整数，包括端点；或者
(c)(GXGVP)
m(
SEQ ID NO:147)
，其中
m
是
10
与
160
之间的整数，包括端点，并且其中每个重复的
X
独立地选自由以下组成的组：甘氨酸
、
丙氨酸
、
缬氨酸
、
异亮氨酸
、
亮氨酸
、
苯丙氨酸
、
酪氨酸
、
色氨酸
、
赖氨酸
、
精氨酸
、
天冬氨酸
、
谷氨酸和丝氨酸
。54.
如权利要求1‑
48
中任一项所述的方法，其中所述具有相行为的多肽包含
SEQ ID NO:88
的氨基酸或
(GVGVPGLGVPGVGVPGLGVPGVGVP)
m
的序列，其中
m
是
16(SEQ ID NO:12)。55.
如权利要求1‑
54
中任一项所述的方法，其中所述融合蛋白包含连接所述第一多肽和所述第二多肽的接头
。56.
如权利要求
55
所述的方法，其中所述接头是可切割的
。57.
如权利要求
55
所述的方法，其中所述接头包含蛋白酶切割位点
。58.
如权利要求
55
所述的方法，其中所述接头是自切割肽
。59.
如权利要求
55
所述的方法，其中所述接头选自由以下组成的组：
i)(G
x
S)
n
(SEQ ID NO:141)
，
ii)(S
x
G)
n
(SEQ ID NO:142)
，
iv)(GGGGS)
n
(SEQ ID NO:19)
，和
v)(G)
n
(SEQ ID NO:48)
；其中
x
是1至6范围内的整数，并且
n
是1至
30
范围内的整数
。60.
如权利要求
55
所述的方法，其中所述接头选自
GKSSGSGSESKS(SEQ ID NO:157)、GSTSGSGKSSEGKG(SEQ ID NO:158)、GSTSGSGKSSEGSGSTKG(SEQ ID NO:159)、GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:160)、EGKSSGSGSESKEF(SEQ ID NO:161)、SRSSG(SEQ ID NO:162)
和
SGSSC(SEQ ID NO:163)。61.
如权利要求1‑
60
中任一项所述的方法，其中所述融合蛋白从
N
末端到
C
末端包含所述第一多肽和所述第二多肽
。62.
如权利要求1‑
60
中任一项所述的方法，其中所述融合蛋白从
N
末端到
C
末端包含所述第二多肽和所述第一多肽
。63.
如权利要求
55
‑
60
中任一项所述的方法，其中所述蛋白从
N
末端到<...

【专利技术属性】
技术研发人员：K，
申请(专利权)人：唐纳森公司，
类型：发明
国别省市：