一种重组纤连蛋白的制备方法技术

本发明专利技术公开一种重组纤连蛋白的制备方法，涉及基因工程技术领域，解决的是重组纤连蛋白制备的纯化和控制问题

【技术实现步骤摘要】
一种重组纤连蛋白的制备方法


[0001]本专利技术涉及基因工程
，且更具体地涉及一种重组纤连蛋白的制备方法
。

技术介绍

[0002]重组
DNA
技术的发展和转化医学研究的需求促进了重组蛋白质的研究与制备
。
纤连蛋白是一种重要的基质蛋白，在机体内广泛存在，其存在状态直接影响了细胞的迁移
、
粘附和增殖等生理过程
。
制备重组纤连蛋白可以提供大量的纯品，有助于进一步研究其在生物学
、
医学等领域的应用，也为诊断
、
治疗和再生医学等方面提供了新的途径
。
[0003]然而，重组纤连蛋白的制备具有以下弊端：
[0004]1.
操作时间较长：整个纯化和制备过程需要较长时间，可能需要几天甚至几周的时间才能完成，这限制了其在实际应用中的快速推广和使用
。
[0005]2.
工艺复杂：纯化和制备过程中涉及到多个步骤和技术，需要专业的技术和经验，如果操作不当会严重影响产量和纯度
。<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种重组纤连蛋白的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤
1、
纤连蛋白肽的理化性质分析
、
蛋白肽结构预测及建模；通过重构预测模块进行纤连蛋白肽的理化性质分析和蛋白肽结构预测及建模，所述理化性质包括亲疏水性
、
基因序列
、
氨基酸数目
、
氨基酸残基
、
脂溶指数和不稳定指数；步骤
2、
配制主要溶液及提取质粒；通过提取配制模块进行主要溶液的配制和质粒的提取，所述主要溶液包括
LB
培养基
、YPD
培养基
、MD
培养基
、BMGY
发酵培养基
、
电泳缓冲液和发酵补料；步骤
3、
合成引物并扩增纤连蛋白基因片段；通过扩增合成模块获取表达载体所用引物及扩增纤连蛋白基因片段；步骤
4、
构建纤连蛋白基因片段；通过连接反应模块构建纤连蛋白基因片段；步骤
5、
菌落鉴定及纤连蛋白表达；通过鉴定表达模块实现培养菌落的鉴定
、
基因测序和纤连蛋白表达；步骤
6、
重组纤连蛋白的发酵与纯化；通过发酵纯化模块获取大量的纯净纤连蛋白；所述发酵纯化模块包括发酵单元
、
分离单元和纯化单元，所述分离单元采用磁选分离和纳米膜分离组合的方法进行纤连蛋白分子的分离，所述发酵单元将获取的菌种按1：
10
转入发酵罐通过加入营养物质和控制条件参数进行发酵培养，所述纯化单元通过亲和层析
、
反相层析和组合凝胶过滤层析联用进行纤连蛋白纯化，所述发酵单元的输出端连接分离单元的输入端，所述分离单元的输出端连接纯化单元的输入端；步骤
7、
合成并应用纤连蛋白产品；所述纤连蛋白产品包括纤连蛋白基质
、
纤连素抗体
、
血纤维蛋白降解产物
、
纤连蛋白支架
、
纤连蛋白凝胶和纤连蛋白检测试剂盒
。2.
根据权利要求1所述的一种重组纤连蛋白的制备方法，其特征在于：所述重构预测模块包括分析单元
、
预测单元和建模单元，所述分析单元通过
ProtParam
分析所选取的纤连蛋白肽的理化性质，所述预测单元通过
TMHMM
预测纤连蛋白肽的跨膜结构域和通过
NetPhos3.1Server
预测纤连蛋白肽的磷酸化位点，所述建模单元通过
SOPMA
和
SWISS
‑
MODEL
为纤连蛋白肽的二级和三级结构建模，所述分析单元的输出端连接预测单元地输入端，所述预测单元的输出端连接建模单元的输入端
。3.
根据权利要求1所述的一种重组纤连蛋白的制备方法，其特征在于：所述提取配制模块包括提取单元和配制单元，所述配制单元用于配制
LB
培养基
、YPD
培养基
、MD
培养基
、BMGY
发酵培养基
、
电泳缓冲液和发酵补料，所述提取单元通过空载体
DH5
α
‑
pPIC9K
在
LB
培养基上获取质粒
pPIC9K。4.
根据权利要求3所述的一种重组纤连蛋白的制备方法，其特征在于：所述
LB
培养基包括胰蛋白胨
15g、
酵母提取物
10g、
氯化钠
9g
和去离子水
1.5L
，调节
PH
值至
7.0
并在
121℃
灭菌
30min
，所述
YPD
培养基包括胰蛋白胨
30g、
酵母提取物
15g、
葡萄糖
30g
和去离子水
1.5L
，并在
115℃
灭菌
30min
，所述
MD
培养基
13.4g
酵母基本氮源；
0.4mg
生物素；
20g
葡萄糖和去离子水
1L
，并在
115℃
灭菌
30min
，所述
BMGY
培养基包括胰蛋白胨
20g/L、YNB13.4g/L、
甘油
20g/L、
酵母提取物
10g/L、
氨基酸
5g/L、
生物素
0.4mg/L、pH
为
6.0
的磷酸钾缓冲体系
0.1M
，并在
115℃
灭菌
15min
，所述电泳缓冲液包括甘氨酸
240mM、Tris
‑
HCl 28mM
和
SDS 0.3
％
。5.
根据权利要求1所述的一种重组纤连蛋白的制备方法，其特征在于：所述扩增合成模块包括引物合成单元和基因扩增单元，所述引物合成单元通过基因重组获取引物干扰素
α
2b
和纤连蛋白受体，所述干扰素
α
2b
的序列为5’‑
AGTGGACCCCGCCGAATGT
‑3’
，所述纤连蛋白受体的序列为5’‑
GCGGTTCGCTTTTCTGATTATTT
‑3’
所述基因扩增单元通过基因合成利用引物将纤连蛋白基因片段扩增，所述引物合成单元的输出端连接基因扩增单元输入端
。6.
根据权利要求5所述的一种重组纤连蛋白的制备方法，其特征在于：所述纤连蛋白基因片段扩增的条件为：通过自适应算法将
50
μ
L PrimeSTAR Max Premix(2
×
)、2
μ
L
干扰素
α
2b、2
μ
L
纤连蛋白受体
、6
μ
L
纤连蛋白基因片段和
45
μ
L
去离子水在
98℃
环境下预变性处理
1.5
分钟后经历
30
个循环，所述循环的温度及时间为：
98℃
，
35s
；
55℃
，
25s
；

【专利技术属性】
技术研发人员：张敏静，胡浩，林健聪，杨高，
申请(专利权)人：广州市合生创研生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：