一种宽吻海豚精液冷冻保存剂及精液冷冻保存方法技术

本发明专利技术提出一种宽吻海豚精液冷冻保存剂及精液冷冻保存方法，属于海豚精液冷冻保存技术领域

【技术实现步骤摘要】
一种宽吻海豚精液冷冻保存剂及精液冷冻保存方法


[0001]本专利技术属于海豚精液冷冻保存
，尤其涉及一种宽吻海豚精液冷冻保存剂及精液冷冻保存方法
。

技术介绍

[0002]随着全球气候变暖和人类活动的影响，海洋生态系统正在发生重大变化
。
这些变化对海豚等海洋生物的生存和繁殖产生了不利影响
。
因此，保护海豚物种的需求越来越迫切，而精液冷冻保存是保护物种遗传资源和促进繁殖的重要手段之一
。
海豚遗传育种是保护海豚物种的重要手段之一，通过对海豚精液的冷冻保存，可以保护和利用珍稀海豚物种的遗传资源，避免其受到不可逆的损失，还可以为海豚生殖生理和基因组学研究提供重要的实验材料
。
[0003]由于陆生动物的精液采集相对容易，精液冷冻保存技术在陆生动物研究领域已相对成熟，但海洋哺乳动物的精液冷冻保存技术却较为缺乏
。
而且，由于鲸豚细胞的渗透压与陆生动物相差甚远，传统的精液冷冻保存剂并不能适用于鲸豚
。
[0004]因而，如何提供一种能够适用于海豚的精液冷冻保存剂及精液冷冻保存方法，以推进珍稀海豚物种保护工作，是当前亟需解决的一项技术问题
。

技术实现思路

[0005]本专利技术针对上述的技术问题，提出一种宽吻海豚精液冷冻保存剂及精液冷冻保存方法，实现了对宽吻海豚精子细胞的长期有效保存，精子存活率高
。
[0006]为了达到上述目的，本专利技术采用的技术方案为：本专利技术一方面提供了一种宽吻海豚精液冷冻保存剂，包括试剂
I
和试剂
II
；其中，试剂
I
包括如下组分：
Tris、
柠檬酸钠
、
链霉素
、
鸡蛋卵黄液
、
去离子水；试剂
II
包括如下组分：葡萄糖
、
乳糖
、
海藻糖
、
柠檬酸钠
、
谷胱甘肽
、
青霉素
、
链霉素
、
鸡蛋卵黄液
、
去离子水和甘油；试剂
I
中，
Tris
的浓度为
30.28 g/L
，柠檬酸钠的浓度为
16.75 g/L
，链霉素的浓度为
0.5 g/L、
鸡蛋卵黄液的体积百分比浓度为
20%
；试剂
II
中，葡萄糖的浓度为
22 g/L
，乳糖的浓度为
37 g/L
，海藻糖的浓度为
8 g/L
，柠檬酸钠的浓度为
6 g/L
，谷胱甘肽的浓度为
0.77 g/L
，青霉素的浓度为
0.6 g/L
，链霉素的浓度为
1 g/L
，鸡蛋卵黄液的体积百分比浓度为
20%
，甘油的体积百分比浓度为
3%。
[0007]作为优选，试剂
I
和试剂
II
的渗透压均为
345
±
5 Osm/kg。
[0008]本专利技术另一方面提供了一种宽吻海豚精液冷冻保存方法，采用上述任一项技术方案所述的宽吻海豚精液冷冻保存剂进行精液冷冻保存，包括以下步骤：制备试剂
I
，并调节试剂
I
的渗透压至
345
±
5 Osm/kg
，用试剂
I
稀释宽吻海豚精液，得到等渗样本液；将试剂
II
中除甘油以外的其他组分混合，并调节渗透压至
345
±
5 Osm/kg
，得到初步降温保护液，置于
36℃
下预热；用预热后的初步降温保护液按体积比
1:1
稀释等渗样本
液，降温至
4~5℃
，得到初步降温样本液；将试剂
II
中的全部组分混合，并调节渗透压至
345
±
5 Osm/kg
，得到冷冻保护液，冷冻保护液中甘油的体积百分比浓度为试剂
II
中的两倍；将冷冻保护液置于
4℃
下预冷，用预冷后的冷冻保护液按体积比
1:1
稀释初步降温样本液，转入冻存管，降温至
‑
4℃
后，投入液氮中冷冻保存
。
[0009]作为优选，采用不同浓度的系列氯化钠溶液进行渗透压调节，系列氯化钠溶液的质量分数分别为
0.3%、0.5%、0.7%、0.9%、1.1%、1.3%、1.5%、1.7%
和
1.9%。
[0010]作为优选，用试剂
I
稀释宽吻海豚精液时，将精子浓度调整至
40x107精子
/ml。
[0011]与现有技术相比，本专利技术的优点和积极效果在于：
1、
本专利技术提供的宽吻海豚精液冷冻保存剂中，试剂
I
作为中间缓存液，用于稀释和转移宽吻海豚精液样本，试剂
II
用于在冷冻过程中起保护作用；其中，葡萄糖
、
乳糖和海藻糖用于提供能量，减少精子细胞自身代谢消耗，保证长期保存所需的代谢消耗；柠檬酸钠用于抑制精子细胞运动；谷胱甘肽用于避免精子细胞产生氧化应激损伤，起保护作用；青霉素和链霉素用于抑菌；鸡蛋卵黄液和甘油能够防止因冷冻或水分升华而对精子细胞造成的损伤，起保护作用；该宽吻海豚精液冷冻保存剂通过各组分的配合作用，实现了对宽吻海豚精子细胞的长期有效保存，精子存活率高；
2、
本专利技术提供的宽吻海豚精液冷冻保存剂，能够保证试剂
I
和试剂
II
的渗透压与宽吻海豚精液的渗透压一致，防止精子的涨裂或缩水，有利于提高精子细胞的存活率；
3、
本专利技术提供的宽吻海豚精液冷冻保存方法，先通过试剂
I
作为缓冲稀释液，获得宽吻海豚精液的等渗样本液，然后采用了两段降温，第一段采用不包含甘油的试剂
II
与宽吻海豚精液的等渗样本液进行混合，初步降温至
4~5℃
，第二段与包含甘油的试剂
II
混合，降温至
‑
4℃
，最后投入液氮中冷冻保存，能够最大程度降低对精子细胞的损伤，保证精子细胞的存活率，实现对宽吻海豚精子细胞的长期有效保存
。
附图说明
[0012]图1为本专利技术实施例1所提供的经苏木素
‑
伊红染色后宽吻海豚精子细胞在显微镜下的照片，其中，
A
为存活精子照片，
B
为死亡精子照片
。
具体实施方式
[0013]下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚
、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1. 一种宽吻海豚精液冷冻保存剂，其特征在于，包括试剂
I
和试剂
II
；其中，所述试剂
I
包括如下组分：
Tris、
柠檬酸钠
、
链霉素
、
鸡蛋卵黄液
、
去离子水；所述试剂
II
包括如下组分：葡萄糖
、
乳糖
、
海藻糖
、
柠檬酸钠
、
谷胱甘肽
、
青霉素
、
链霉素
、
鸡蛋卵黄液
、
去离子水和甘油；所述试剂
I
中，
Tris
的浓度为
30.28 g/L
，柠檬酸钠的浓度为
16.75 g/L
，链霉素的浓度为
0.5 g/L、
鸡蛋卵黄液的体积百分比浓度为
20%
；所述试剂
II
中，葡萄糖的浓度为
22 g/L
，乳糖的浓度为
37 g/L
，海藻糖的浓度为
8 g/L
，柠檬酸钠的浓度为
6 g/L
，谷胱甘肽的浓度为
0.77 g/L
，青霉素的浓度为
0.6 g/L
，链霉素的浓度为
1 g/L
，鸡蛋卵黄液的体积百分比浓度为
20%
，甘油的体积百分比浓度为
3%。2. 根据权利要求1所述的宽吻海豚精液冷冻保存剂，其特征在于，所述试剂
I
和所述试剂
II
的渗透压均为
345
±

【专利技术属性】
技术研发人员：袁世鹏，齐洁，刘滨，王一帆，唐学大，谭永明，
申请(专利权)人：青岛海洋科技中心，
类型：发明
国别省市：