一种侏儒蛤精子超低温冷冻保存方法技术

本发明专利技术提出了一种侏儒蛤精子超低温冷冻保存方法，包括取繁殖期的侏儒蛤，采用阴干和变温刺激使侏儒蛤自然排精，过滤，离心，在高密度精子中加入冷冻保护液，混合，置于冰上，得预处理精子；所述冷冻保护液由体积比为

【技术实现步骤摘要】
一种侏儒蛤精子超低温冷冻保存方法


[0001]本专利技术涉及海洋生物
，特别涉及一种侏儒蛤精子超低温冷冻保存方法
。

技术介绍

[0002]精子超低温冷冻保存技术自上世纪
50
年代首次成功以来，经过半个多世纪的发展，目前在动物种质资源保护和遗传育种研究中发挥重要作用
。
然而近年来在哺乳动物和水生动物研究中发现，应用冷冻精子得到的后代在生长和存活方面存在问题
。
在海水双壳贝类中，虽然已报道过牡蛎
、
贻贝和扇贝等物种的精子超低温冷冻保存方法，但是目前还没有针对冷冻精子得到后代的表现开展研究
。
常见的经济海水双壳贝类由于其性成熟时间较长，并且其大部分时间都生长在海上，对于研究具有一定的困难
。
因此，选择一个适合的模式生物进行研究非常重要
。
侏儒蛤属于帘蛤目，蛤蜊科，是海水双壳贝类研究的模式生物，并且研究结果也已经应用于经济海水双壳贝类中
。
例如，
Yang and Guo(2006)
采用侏儒蛤为研究对象，开发海水双壳贝类多倍体繁育方法
。Guo
等人
(2023)
应用侏儒蛤开展双壳贝类幼虫贝壳形成机制研究
。
与其它海水双壳贝类相比，侏儒蛤具有性成熟周期短
(
大约2个月
)
的特点，而且侏儒蛤整个生命周期养殖方法和基因组均已由本申请人所在实验室建立完成
。r/>研究侏儒蛤超低温冷冻保存影响由冷冻精子发育而成的后代的理想材料
。

技术实现思路

[0003]鉴于此，本专利技术的目的在于提出一种侏儒蛤精子超低温冷冻保存方法
。
[0004]本专利技术的技术方案是这样实现的：
[0005]一种侏儒蛤精子超低温冷冻保存方法，包括如下步骤：
[0006]S1
取繁殖期的侏儒蛤，采用阴干和变温刺激使侏儒蛤自然排精，过滤，离心，得高密度精子；
[0007]S2
在高密度精子中加入冷冻保护液，混合，置于冰上，得预处理精子；所述冷冻保护液由体积比为
100
：
12
～
20
的海水和二甲基亚砜组成；
[0008]S3
将预处理精子置于液氮面上预冷后，浸入液氮中保存
。
[0009]进一步方案是，所述阴干为在
24
～
26℃
温度下阴干
60
～
90min。
[0010]进一步方案是，所述变温刺激为将侏儒蛤在
26
～
27℃
温度的海水中自然排精
。
[0011]进一步方案是，所述过滤的目数为
24
～
90
μ
m
；过滤后，挑取活力大于
85
％的精子进行离心
。
[0012]进一步方案是，所述离心的条件为：相对离心力为
1800
～
2200rcf
，时间为4～
6min。
[0013]进一步方案是，步骤
S2
中，所述置于冰上的时间为8～
12min。
[0014]进一步方案是，步骤
S3
中，所述预冷为在置于液氮面至少
4cm
以上，预冷处理8～
12min。
[0015]进一步方案是，所述高密度精子的密度为1～2×
108mL
‑1。
[0016]进一步方案是，侏儒蛤精子浸入液氮中保存后的解冻方法为在
50
～
60℃
水浴锅中解冻5‑
6s。
[0017]与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：
[0018]本专利技术提供的侏儒蛤精子的冷冻保存方法，有助于减轻精子受损程度
、
减少过量有毒物质对精子膜的破损，在
60℃
条件下解冻复苏，其冷冻精子受精后，
D
形幼虫率达到
80
％以上，可适合用于研究超低温冷冻保存对由冷冻精子发育而成后代的影响，冷冻精子得到的后代具有较好的存活率以及生长率等
。
附图说明
[0019]图1为侏儒蛤新鲜精子扫描电镜图，
A
‑
B
为不同放大倍数下的新鲜精子，
C
为单一新鲜精子结构，
D
为新鲜精子具有细长的鞭毛，其中，
f:
鞭毛，
h:
头部，
mp:
中部，
a:
顶体；
[0020]图2为实施例1侏儒蛤超低温冷冻精子扫描电镜图，
A
‑
C
为不同放大倍数下的冷冻精子，
D
为受损鞭毛的单个冷冻精子，
E
为头部和鞭毛肿胀的单个冷冻精子，
F
为头部
、
中部和顶体异常的单一冷冻精子的放大图，其中，
f:
鞭毛，
h:
头部，
mp:
中部，
a:
顶体；
[0021]图3为侏儒蛤新鲜精子透射电镜图，
A
‑
C
为新鲜精子纵切面显示不同结构，
D
为精子中部横截面，
E
为精子鞭毛纵切面，
F
为精子鞭毛横切面显示轴丝及“9+2”微管结构，其中，
n:
核，
m:
线粒体，
h:
头部，
pm:
质膜，
ne:
核膜，
nv:
核小泡，
pc:
近端中心粒，
dc:
远端中心粒，
f:
鞭毛，
mc:
线粒体嵴，
c:
中心体，
ct:
中央微管，
pt:
外周微管，
fpm:
鞭毛质膜，
cdm:
微管中心双元件，
pdm:
微管外周双元件；
[0022]图4为侏儒蛤新鲜精子透射电镜图，
A
‑
B
为冷冻精子纵切面显示不同结构，
C
‑
D
为精子中部横截面，
E
为精子鞭毛纵切面，
F
为精子鞭毛横切面，其中，
n:
核，
h:
头部，
v:
囊泡，
m:
线粒体，
pm:
质膜，
ne:
核膜，
ax:
轴丝，
c:
中心体，
f:
鞭毛，
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种侏儒蛤精子超低温冷冻保存方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1
取繁殖期的侏儒蛤，采用阴干和变温刺激使侏儒蛤自然排精，过滤，离心，得高密度精子；
S2
在高密度精子中加入冷冻保护液，混合，置于冰上，得预处理精子；所述冷冻保护液由体积比为
100
：
12
～
20
的海水和二甲基亚砜组成；
S3
将预处理精子置于液氮面上预冷后，浸入液氮中保存
。2.
根据权利要求1所述的一种侏儒蛤精子超低温冷冻保存方法，其特征在于，所述阴干为在
24
～
26℃
温度下阴干
60
～
90min。3.
根据权利要求1所述的一种侏儒蛤精子超低温冷冻保存方法，其特征在于，所述变温刺激为将侏儒蛤在
26
～
27℃
温度的海水中自然排精
。4.
根据权利要求1所述的一种侏儒蛤精子超低温冷冻保存方法，其特征在于，所述过滤的目数为
24
～
90
μ

【专利技术属性】
技术研发人员：刘一兵，徐镇，黄晓婷，杨祖晶，赵昂，包立随，胡景杰，王孟强，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：