一种单向性羊膜脱细胞基质制造技术

本发明专利技术提供了一种单向性羊膜脱细胞基质

【技术实现步骤摘要】
一种单向性羊膜脱细胞基质、制备方法及应用


[0001]本专利技术属于低温医学
，涉及一种单向性羊膜脱细胞基质
、
制备方法及应用
。

技术介绍

[0002]细胞支架材料是组织工程学研究的重点之一
。
在体内组织再生过程中，细胞支架材料能够加强组织缺损部位的结构强度，阻碍周围组织的长入
。
细胞支架材料可以作为体外接种细胞在体内增殖的支架，也可以作为一种可溶性细胞功能调节因子，还可以作为细胞
、
生长因子和基因载体的重要作用
。
[0003]羊膜是哺乳动物胎盘的一种重要结构，是一种透明
、
有韧性，无神经
、
血管
、
淋巴管分布的天然生物膜
。
羊膜具有抗原性低
、
排异反应小
、
可分泌多种生长因子并含有多种炎性因子及新生血管抑制因子等生物学特性，并且它本身含有多种胶原和神经生长因子，是一种良好的生物活性载体，可以作为细胞支架材料
。
人羊膜的基底膜较厚
、
韧性强，不但具有支架作用，而且含有层粘连素
、
纤维粘连素
、Ⅳ型胶原
、
大量硫酸乙酰肝素蛋白多糖，以及其他一些蛋白多糖大分子和神经营养因子
。
人羊膜光滑透明，无血管
、
淋巴和神经系统，组织相容性好
、
易于取材，丰富的胶原网架结构增强柔韧性，也能抗粘连
、
抗感染并保护创面，已经广泛应用于眼科
、
烧伤
、
腹腔和盆腔手术中
。
处理后的羊膜细胞外基质不含有细胞结构，主要成分为胶原纤维
、
网状纤维和基质，用于临床移植术后几乎不发生免疫排斥反应，对于细胞的黏附和增殖生长也有重要的促进作用
。
[0004]羊膜经脱细胞处理成为羊膜脱细胞基质，该羊膜脱细胞基质是一种特殊的细胞外基质，作为细胞培养的生物载体，特别是作为生物活性载体，已经用于干细胞体外培养
。
现有的羊膜脱细胞基质的制备方法包括单向式羊膜脱细胞方法，该方法包括：
a)
新鲜羊膜的剥离和清洗；
b)
将羊膜平铺固定在具有平面的支撑体上；
c) 将羊膜放入脱细胞溶液中处理；
d)
将羊膜洗涤后放入核酸酶溶液中处理；
e)
将羊膜洗涤后得到人脱细胞羊膜
。
该制备方法中，脱细胞溶液包括主成分及配制溶液，其中，主成分选择
TrypLE
TM
Select Enzyme、
胰蛋白酶
、
中性蛋白酶
、
非离子型去污剂
、
两性离子去污剂的组合；配制溶液为无菌的
0.9
％氯化钠注射液
、
磷酸盐缓冲液
、D
‑
Hanks
溶液或
HEPES
溶液
。
脱细胞溶液的成分复杂，操作复杂，难以实现工业化
。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种单向性羊膜脱细胞基质
、
制备方法及应用，以解决现有单向性羊膜脱细胞基质制备工艺复杂
、
难以实现工业化的问题
。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：本申请提供一种单向性羊膜脱细胞基质的制备方法，包括：羊膜脱细胞基质在液氮保护下充分研磨后，放入预冻装置中进行预冻，得到取向性微通道排列的单向性羊膜脱细胞基质；其中，所述预冻装置包括箱体和扣合在所述箱体上的盖板，所述箱体内部底面上
铺设高温隔热垫
。
预冻装置按照
1℃/min
的降温速度从室温降至
‑
80℃
，存储于超低温冰箱内
。
[0007]在本申请中，预冻装置只有箱体的底部铺设高温隔热垫
。
放入预冻装置的羊膜脱细胞基质在冷冻时，靠近预冻装置底部的羊膜脱细胞基质的降温速度慢，靠近预冻装置顶部的羊膜脱细胞基质的降温速度快，由此，羊膜脱细胞基质在冷冻过程中会形成单向性冰晶，达到制备单向性羊膜脱细胞基质的目的
。
[0008]在本申请中，羊膜脱细胞基质的制备方法包括：
S01
：羊膜切片后放入脱氧胆酸钠溶液中脱细胞处理，生理盐水冲洗，得到脱细胞羊膜
。
[0009]将新鲜的胎盘充分清洗后，分离羊膜组织
。
将分离出的羊膜组织进行切片处理，室温下充分洗涤
。
将切好片的羊膜与浓度为
0.5%
的脱氧胆酸钠溶液按照质量比为
1:3
‑
1:4
混合，在摇床转速为
60
‑
80rpm
的条件下摇床震荡
16
‑
24h
，以脱去羊膜中的细胞
。
[0010]羊膜脱细胞处理结束后，在摇床转速为
60
‑
80rpm
的条件下，采用生理盐水冲洗脱细胞处理的羊膜2次，每次2‑
3h
，得到脱细胞羊膜
。
[0011]脱氧胆酸钠是一种离子去垢剂，其可以溶解细胞膜上的膜蛋白等蛋白质，进而破坏细胞的膜结构
。
通过脱氧胆酸钠溶液浸泡后的羊膜通过生理盐水的洗涤能够脱去细胞，实现羊膜的脱细胞处理
。
[0012]S02
：采用
DNase
酶处理所述脱细胞羊膜，生理盐水冲洗，得到酶处理羊膜
.
将
DNase
酶与脱细胞羊膜配制为浓度为
1000U/L
的
DNase
酶
/
脱细胞羊膜混合液，在摇床转速为
60
‑
80rpm
的条件下摇床震荡
12
‑
24h。DNase
酶主要对细胞内的
DNA
等基因成分进行酶解，使其失去活性，进而使得制备的羊膜脱细胞基质更加安全
。
[0013]脱细胞羊膜酶处理结束后，在摇床转速为
60
‑
80rpm
的条件下，采用生理盐水冲洗脱细胞处理的羊膜2次，每次2‑
3h
，得到酶处理羊膜
。
[0014]S03
：对所述酶处理羊膜病毒灭活，生理盐水冲洗，得到羊膜脱细胞基质
。
[0015]将过氧乙酸溶液加入到磷酸氢二钠溶液中，混合形成浓度为
0.2%
的混合液
。
该混合液现用现配
。
采用上述混合液快速冲洗所述酶处理羊膜3‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种单向性羊膜脱细胞基质的制备方法，其特征在于，包括：羊膜脱细胞基质在液氮保护下充分研磨后，放入预冻装置中进行预冻，得到取向性微通道排列的单向性羊膜脱细胞基质；其中，所述预冻装置包括箱体和扣合在所述箱体上的盖板，所述箱体内部底面上铺设高温隔热垫
。2.
根据权利要求1所述的单向性羊膜脱细胞基质的制备方法，其特征在于，所述预冻装置按照
1℃/min
的降温速度从室温降至
‑
80℃。3.
根据权利要求1所述的单向性羊膜脱细胞基质的制备方法，其特征在于，所述羊膜脱细胞基质的制备方法包括：羊膜切片后放入脱氧胆酸钠溶液中脱细胞处理，生理盐水冲洗，得到脱细胞羊膜；采用
DNase
酶处理所述脱细胞羊膜，生理盐水冲洗，得到酶处理羊膜；对所述酶处理羊膜病毒灭活，生理盐水冲洗，得到羊膜脱细胞基质
。4.
根据权利要求3所述的单向性羊膜脱细胞基质的制备方法，其特征在于，所述羊膜与浓度为
0.5%
的所述脱氧胆酸钠溶液按照质量比为
1:3
‑
1:4
混合，在摇床转速为
60
‑
80rpm
的条件下摇床震荡
16
‑
24h。5.
根据权利要求3所述的单向性羊膜脱细胞基质的制备方法，其特征在于，在摇床转速为
60
‑
80rpm...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴晓宇，赵莎莎，李栋，
申请(专利权)人：济南万泉生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：