基于制造技术

本发明专利技术公开了一种基于

【技术实现步骤摘要】
基于3D DNA Walker的点击式电化学发光生物传感器及其应用


[0001]本专利技术涉及生物分析检测领域，具体涉及基于
3D DNA Walker
的点击式电化学发光生物传感器及其在制备用于检测心梗
miRNA
的检测体系中的应用
。

技术介绍

[0002]急性心肌梗死
(AMI)
是一种严重的心血管疾病
。
长期缺血会导致心肌组织死亡，甚至心力衰竭，对健康具有重大影响
。
因此，
AMI
的早期诊断和治疗尤为重要
。
目前的研究表明，血液循环系统中存在与
AMI
相关的
miRNA。
这些
miRNA
是一类约由
22
个核苷酸组成的非编码单链
RNA
，在基因表达中通过抑制
mRNA
翻译或促进
mRNA
降解起核心调控作用，与多种生物学过程相关，如细胞分化
、
增殖
、
凋亡和转化，具有高度的特异性和稳定性
。
成熟的
miRNA
可通过被动释放或进入脂蛋白复合物到达复杂的血液环境中
。
研究证实，这些到达血液中的
miRNA
含量极低，是各种疾病的发病原
。
因此，建立稳定
、
高效的生物传感平台精准检测
miRNA
势在必行
>。
[0003]电化学发光
(ECL)
技术结合了电化学和发光分析的优点，以低背景
、
设备简单
、
高灵敏度和高可控性成为心肌梗死
miRNA
检测的主流分析方法
。
然而，仅使用
ECL
技术构建传感平台，而没有用于信号放大的核酸放大方法，传感器的检测灵敏度相对较低
。
因此，需要将电化学发光技术与核酸扩增传感原理相结合，可用于准确分析和检测
AMI
相关
miRNA。
然而，用于精确检测
miRNA
的定量逆转录聚合酶链反应需要消耗大量样品，以及通过耗时程序完成的复杂仪器
。
为了避免使用复杂仪器，同时在短时间内实现信号的连续累积，提出了基于滚动循环扩增
(RCA)
反应的循环
miRNA
分析
。
考虑到
miRNA
中滚动环扩增的实际检测涉及模板和酶的参与，其易于产生假阳性信号和高背景信号干扰
。
随后，无酶裂解发夹自组装
(CHA)、
杂交链式反应
(HCR)
和链置换扩增
(SDA)
被开发为易于操作的核酸扩增手段，然而，它们缺乏检测复杂血液环境中
miRNA
的灵敏度和特异性
。
[0004]DNA
步行机是一种典型的动态
DNA
装置，以
DNA、ATP
和其他小分子作为燃料，通过偏置布朗运动在微尺度或纳米尺度上进行机械移动
。
三维
DNA
步行机
(3D DNA Walker)
是一种典型的
DNA
步行机，由于粒子大的表面体积比和高
DNA
负载密度，一旦驱动粒子间相对运动的
3D DNA Walker
被靶标激活，行走粒子
(WPs)
中的多步行走链与轨道粒子
(TPs)
上的轨道链协同结合，这些链稳定且不易脱轨
。
通过行走粒子
(WPs)
和轨道粒子
(TPs)
之间的连续相互作用，并实现了大信号积累
。
由于
DNA
的高化学稳定性
、
易于合成
、
易于修饰和较低的生产成本，
3D DNA Walker
已被用于多种传感平台，它们在核酸检测领域具有新兴的和有前景的应用前景
。
[0005]Cu(I)(
由
AA
还原
Cu
2+
产生
)
催化的点击化学反应因其高选择性
、
高效连接和温和的反应条件而广泛应用于生物传感器平台
。
同时，与连接酶比，
Cu(I)
催化的点击化学反应有更低的生产成本，可实现
92
％以上的连接效率
。
然而，在实践中，点击反应仅仅作为连接不能用于信号放大，因此难以满足灵敏检测血液中低丰度
miRNA
的实际需求
。

技术实现思路

[0006]为了提高传感器的性能，充分利用点击反应的有效连接效率，同时确保构建的生物传感器具有优异的信号放大性能，本专利技术通过粒子间相对运动的
3D DNA Walker
耦合点击反应建构的三明治生物传感平台可实现
miRNA
的准确识别和稳定高效检测
。
该生物传感方案与常规的生物传感方案相比，大大提高了心肌
miRNA
的检测效率的和稳定性，为
ECL
传感平台精准检测
miRNA
提供更多可靠思路
。
[0007]本专利技术设计合成了粒子间相对运动的
3D DNAWalker
，以实现连接器的级联放大，同时连接器可用于优异稳定性
、
高连接效率
、
一端含有
AgNCs
的点击化学反应构建的三明治传感平台
。AgNCs
作为
ECL
信号的发光体，具有低毒性
、
良好的生物相容性和良好稳定性等特点，已广泛用作检测各种生物的
ECL
发光体
。
[0008]本专利技术的一种
ECL
生物传感器，采用下述方法制备得到：
(1)、
预处理电极；
(2)、
将叠氮
DNA(Azido
‑
S3)
修饰于电极表面；
(3)、
加
MCH(
巯基聚乙二醇
SH
‑
PEG)
防止非特异性结合；
(4)、
加入由巯基
DNA(DNA
‑
SH)、
行走链
(walking strand)、
锁定链
(locking strand)
和
AuNPs
组成的行走粒子
WPs
，由巯基
DNA(DNA
‑
SH)、
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种基于
3D DNAWalker
的点击式电化学发光生物传感器，采用包括下述步骤的方法得到：
(1)
预处理电极；
(2)
将叠氮
DNA
即
Azido
‑
S3
修饰于电极表面；
(3)
加
MCH
防止非特异性结合；
(4)
将行走粒子
WPs
和轨道粒子
TPs
混合并加入
miRNA
建构粒子间相对运动的
3D DNA Walker
，生成连接器
S1
；所述行走粒子
WPs
由巯基
DNA、walking strand、locking strand
和
AuNPs
退火形成，轨道粒子
TPs
由巯基
DNA、Si
‑
Hp(rA)
和
AuNPs
退火形成；
(5)
加入炔基
DNA
即
Alkynyl
‑
S2、
连接器
S1、
催化剂
Cu
2+
和抗坏血酸钠
AA
，将其共同修饰于电极表面，发生具有三明治结构的点击化学反应；
(6)
将
AgNO3溶液滴到修饰好电极的表面，再用
NaBH4进行还原得到修饰电极，将其与其他电极结合形成
ECL
生物传感器
。2.
如权利要求1所述生物传感器，其特征在于，步骤
(1)
预处理包括抛光
、
清洗
、
干燥
。3.
如权利要求1所述生物传感器，其特征在于，步骤
(2)
修饰于电极表面是指将
Azido
‑
S3
于电极上孵育；所述
Azido
‑
S3
序列为序列表中
SEQ ID NO.1。4.
如权利要求1所述生物传感器，其特征在于，步骤
(2)
先电化学沉积
HAuCl4再将
Azido
‑
S3
修饰于电极表面
。5.
如权利要求1所述生物传感器，其特征在于，步骤
(4)
中行走粒子
WPs
由巯基
DNA、walking strand、locking strand
和
AuNPs
于
90℃
退火
10
分钟形成，轨道粒子
TPs
由巯基
DNA、Si
‑
Hp(rA)
和
AuNPs
于
90℃
退火
10
分钟形成；将退火形成的两种粒子混合后加入
miRNA,
再加
Mg
2+
孵育
24h
离心；所述巯基
DNA、walking strand、locking strand、Si
‑
Hp(rA)
序列分别为序列表中
SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3
和
SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5。6.
如权利要求1所述生物传感器，其特征在于，步骤
(5)
将经退火的
Alkynyl
‑
S2、
...

【专利技术属性】
技术研发人员：张奎，张喆，程熙，孙玉蝶，
申请(专利权)人：安徽工业大学，
类型：发明
国别省市：