级联循环放大介导的免标记电化学传感制造技术

本发明专利技术公开了级联循环放大介导的免标记电化学传感的构建方法

【技术实现步骤摘要】
级联循环放大介导的免标记电化学传感


[0001]本专利技术涉及电化学生物传感器领域，具体涉及级联循环放大介导的免标记电化学传感的构建方法
、
构建结构及应用
。

技术介绍

[0002]MicroRNA(miRNA)
是一类内源性的非编码
RNA
分子，它可以调节细胞生长
、
分化
、
凋亡等过程
。
据报道，
miRNA
的表达水平发生异常通常会牵涉到多种人类疾病
。
例如，
miRNA 122
在健康的肝细胞中特异性地高度表达，每个正常肝细胞约
40000
个拷贝
。
当肝脏发生损伤时，
miRNA 122
会从肝细胞中释放出来，使得血液中的含量增加
100
至
1000
倍
。
此外，非
miRNA 122
表达的肝癌细胞中恢复
miRNA 122
的表达可以逆转它们的致癌性
。
因此，研究高效的
miRNA 122
检测方法对肝脏疾病的临床诊断和药物开发具有重要意义
。
[0003]由于
miRNA
的丰度低，可能低于激活传感探针的浓度阈值，因此对于检测的灵敏度要求较高
。
而电化学传感器结合了电子传导元件与生物识别元件，具有灵敏度高
、
响应快r/>、
成本低
、
操作简单
、
小型化等优点
。
同时，为了进一步提高灵敏度，科研工作者们开发了多种
DNA
扩增方法，包括蛋白酶辅助放大技术和无酶扩增技术
。
尽管蛋白酶能有效地进行信号放大，但这类传感器往往成本高
、
蛋白酶稳定性弱
、
实验操作复杂
。
相比之下，杂交链式反应
(HCR)、toehold
介导的链式置换反应
、
催化发夹自组装和
DNAzyme
技术，这些无酶扩增方法操作简便
、
易于调控
、
并具有出色的信号放大能力，可以用于不同的生物标志物检测
。
例如，本课题组之前设计了一个新型的哑铃状探针，结合
DNAzyme
剪切放大反应，构建了一个交叉触发和级联循环扩增的电化学传感器，可以实现对
miRNA
的灵敏检测，检测限低至
0.34fM。
尽管该传感器取得了显著的成就，但它需要标记亚甲基蓝
(MB)
作为信号分子，这会增加实验的复杂性并影响生物分子的潜在活性
。
此外，标记信号分子的程序往往耗时耗力，而且合成电活性分子修饰的核酸探针成本很高
。
为了解决这一问题，本专利技术通过设计原位合成银纳米簇构建免标记电化学传感器，以避免标记过程的繁琐步骤和标记试剂的二次检测造成的干扰
。

技术实现思路

[0004]本专利技术所要解决的技术问题是提供一种级联循环放大介导的免标记电化学传感的构建方法
、
构建结构及应用，利用
DNAzyme
技术和链置换反应实现目标物的级联循环放大，以
DNA
为模板原位合成银纳米簇，实现血清样品中
miRNA 122
的灵敏检测
。
[0005]为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案为：级联循环放大介导的免标记电化学传感，其创新点在于：所述级联循环放大介导的免标记电化学传感包括以下步骤：
[0006]步骤
S1
：通过两步合成法制备纳米合金包覆的金属有机框架复合材料
AuPd@CoMOF
，分散到玻碳电极表面形成传感基底
AuPd@CoMOF/GCE
；
[0007]步骤
S2
：将固定探针
IP
固定到
AuPd@CoMOF/GCE
表面，并用巯基己醇
MCH
进行封闭得到
MCH/IP/AuPd@CoMOF/GCE
；
[0008]其中，所述
IP
的序列为5’‑
SH
‑
(CH2)6‑
TTTTTTTAGGCAAGAGAGCAT
‑3’
；
[0009]步骤
S3
：将
DNAzyme
探针
DP
与封闭探针
BP
进行杂交得到
DP/BP
双链，同时将辅助探针
AP1
与
AP2、
信号探针
SP
杂交得到
AP1/AP2
‑
SP
；
[0010]其中，所述
DP
的序列为5’‑
GTCAACGTCCGAGCCGGTCGAAATGGAGTGTGA
‑3’
，所述
BP
的序列为5’‑
CCATTGTCACACTCCATTT
‑3’
，所述
AP1
的序列为5’‑
GTCAACGTCCGAGCTAGGCAAGAGAGCATAGGGTGATGATAACTGAGACTGTC
‑3’
，所述
AP2
的序列为5’‑
CTCAGTTATCATCACCCT
‑3’
，所述
SP
的序列为5’‑
ATGCTCTCTTGCCTACCCCCCCCCCCC
‑3’
；
[0011]步骤
S4
：将
DP/BP、miRNA 122、AP1/AP2
‑
SP、AP3
混合，滴加至步骤
S2
得到的
MCH/IP/AuPd@CoMOF/GCE
界面反应；
[0012]其中，所述
miRNA 122
的序列为5’‑
UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG
‑3’
，所述
AP3
的序列为5’‑
CTCAGTTATCATCACCCTATGCTCTCTTGCCTACGGTCGAAATGGAGTGTGA
‑3’
；
[0013]步骤
S5
：在步骤
S4
界面反应完成后加入硝酸银孵育，孵育后冲洗，冲洗完成后滴入硼氢化钠原位合成银纳米簇
。
[0014]优选的，所述步骤
S1
中合成纳米材料的操作为，将二价钴的无机盐
(
如氯化钴
)
和本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
级联循环放大介导的免标记电化学传感，其特征在于：所述级联循环放大介导的免标记电化学传感包括以下步骤：步骤
S1
：通过两步合成法制备纳米合金包覆的金属有机框架复合材料
AuPd@CoMOF
，分散到玻碳电极表面形成传感基底
AuPd@CoMOF/GCE
；步骤
S2
：将固定探针
IP
固定到
AuPd@CoMOF/GCE
表面，并用巯基己醇
MCH
进行封闭得到
MCH/IP/AuPd@CoMOF/GCE
；其中，所述
IP
的序列为5’‑
SH
‑
(CH2)6‑
TTTTTTTAGGCAAGAGAGCAT
‑3’
；步骤
S3
：将
DNAzyme
探针
DP
与封闭探针
BP
进行杂交得到
DP/BP
双链，同时将辅助探针
AP1
与
AP2、
信号探针
SP
杂交得到
AP1/AP2
‑
SP
；其中，所述
DP
的序列为5’‑
GTCAACGTCCGAGCCGGTCGAAATGGAGTGTGA
‑3’
，所述
BP
的序列为5’‑
CCATTGTCACACTCCATTT
‑3’
，所述
AP1
的序列为5’‑
GTCAACGTCCGAGCTAGGCAAGAGAGCATAGGGTGATGATAACTGAGACTGTC
‑3’
，所述
AP2
的序列为5’‑
CTCAGTTATCATCACCCT
‑3’
，所述
SP
的序列为5’‑
ATGCTCTCTTGCCTACCCCCCCCCCCC
‑3’
；步骤
S4
：将
DP/BP、miRNA122、AP1/AP2
‑
SP、AP3
混合，滴加至步骤
S2
得到的
MCH/IP/AuPd@CoMOF/GCE
界面反应；其中，所述
miRNA 122
的序列为5’‑
UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG
‑3’
，所述
AP3
的序列为5’‑
CTCAGTTATCATCACCCTATGCTCTCTTGCCTACGGTCGAAATGGAGTGTGA
‑3’
；步骤
S5
：在步骤
S4
界面反应完成后加入硝酸银孵育，孵育后冲洗，冲洗完成后滴入硼氢化钠原位合成银纳米簇
。2.
如权利要求1所述的级联循环放大介导的免标记电化学传感，其特征在于：所述步骤
S1
中合成纳米材料的操作为，将二价钴的无机盐
(
如氯化钴
)
和
2,5
‑
二羟基对苯二甲酸溶解到二甲基甲酰胺中，于
120℃
下反应
26<...

【专利技术属性】
技术研发人员：豆保婷，李智敏，王科铭，陈艳，王颇，
申请(专利权)人：李智敏，
类型：发明
国别省市：