一种耐碱突变蛋白制造技术

本申请公开了一种耐碱突变蛋白

【技术实现步骤摘要】
一种耐碱突变蛋白SPA
‑
5及其构建方法


[0001]本申请涉及生物工程领域，具体而言，涉及一种耐碱突变蛋白
SPA
‑5及其构建方法
。

技术介绍

[0002]在蛋白分子的生产过程中需要去除污染物以确保蛋白产品的纯度
。
这些污染物包括非目的的生物分子或微生物如蛋白质
、
碳水化合物
、
脂类
、
细菌和病毒等
。
通常在目的产物洗脱后即从基质去除这些污染物，以便在随后的应用之前再生基质
。
此类去除通常包括被成为就地清洗
(CIP)
方法，其中使用了能够从固定相洗脱污染物的试剂
。
目前使用的最广泛的此类试剂是
NaOH
，浓度可根据污染的程度和基质性质从
0.1M
至
1M
不等
。NaOH
是一种能实现多途径地减少诸如微生物
、
蛋白质
、
脂质
、
核酸等污染物的有效
CIP
试剂
。NaOH
另一个优点是其很容易被去除而不用任何进一步处理
。
但此方案需要将基质暴露在
pH
超过
13
的极端碱性条件下，对基质耐碱能力要求很高
。

技术实现思路

[0003]本申请的内容部分用于以简要的形式介绍构思，这些构思将在后面的具体实施方式部分被详细描述
。
本申请的内容部分并不旨在标识要求保护的技术方案的关键特征或必要特征，也不旨在用于限制所要求的保护的技术方案的范围
。
[0004]为了解决以上
技术介绍
部分提到的技术问题，本申请的第一目的是提供了一种耐碱突变蛋白
SPA
‑5，其特征在于，包括
[0005]部分
SEQ ID NO.1
的序列
。
[0006]进一步地，
[0007]所述耐碱突变蛋白
SPA
‑5在
A
结构域的基因序列为：
SEQ ID NO.2。
[0008]进一步地，
[0009]耐碱突变蛋白
SPA
‑5包括至少
70
％的
SEQ ID NO.1
的序列
。
[0010]进一步地，
[0011]耐碱突变蛋白
SPA
‑5包括至少
80
％的
SEQ ID NO.1
的序列
。
[0012]进一步地，
[0013]耐碱突变蛋白
SPA
‑5包括至少
95
％的
SEQ ID NO.1
的序列
。
[0014]本申请的第二目的提供一种上述述的耐碱蛋白的构建方法：包括以下步骤：
[0015]S1.
获取
SPA11
蛋白表达前体载体，并以
SPA11
蛋白表达前体载体作为
PCR
的模板；
[0016]S2.
获取六种设计引物，分别为
DomainAF1'、DomainAR1'、DomainAF2'、DomainAR2'、DomainAF3'、DomainAR3'。
[0017]S3.
将六中设计引物和模板进行第一
PCR
处理
、
第一酶切处理
、
第一
T4
连接处和第一培养处理得到质粒；
[0018]S4.
获取
DomainAF4'
和
DomainAR4'
，以
DomainAF4'
和
DomainAR4'
为引物，质粒为载
体，进行第二
PCR
处理
、
第二酶切处理
、
第二
T4
连接处和第二培养处理得到耐碱蛋白
。
[0019]进一步地，
[0020]SEQ ID NO.1
[0021]所述
DomainA F1'
的序列为：
SEQ ID NO.3
；
[0022]所述
DomainA R1'
的序列为：
SEQ ID NO.4
；
[0023]所述
DomainAF2'
的序列为：
SEQ ID NO.5
；
[0024]所述
DomainA R2'
的序列为：
SEQ ID NO.6
；
[0025]所述
DomainA F3'
的序列为：
SEQ ID NO.7
；
[0026]所述
DomainA R3'
的序列为：
SEQ ID NO.8。
[0027]进一步地，
[0028]所述
DomainA F4'
的序列为：
SEQ ID NO.9。
[0029]所述
DomainAR4'
的序列为：
SEQ ID NO.10。
[0030]进一步地，
[0031]第一
PCR
处理的方法包括：
[0032]将
DomainA F1'、DomainA R1'、DomainA F2'、DomainA R2'、DomainA F3'、DomainA R3'
和
SPA 11
蛋白表达前体载体进行
PCR
；然后加入
DomainA F1'
和
DomainA R3'
进行重叠
PCR
处理；得到
fragment
‑1；
[0033]第一酶切处理和第一
T4
连接的方法包括：
[0034]对
fragment
‑1和
SPA 11
蛋白表达前体载体同时进行
<Xbal,SalI>
双酶切，将酶切产物进行
T4
连接，得到第一连接产物；
[0035]第一培养处理的方法包括：
[0036]第一将连接产物转化
DH5a
感受态，在
Kana
压力筛选，挑出测序结果正确的单克隆并提取质粒
。
[0037]进一步地，
[0038]所述第二
PCR
处理的方法包括：
[0039]以
DomainA F4'
和
DomainA R4'
为引物和所述质粒为载本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种耐碱突变蛋白
SPA
‑5，其特征在于，包括部分
SEQ ID NO.1
的序列
。2.
根据权利要求1所述的耐碱突变蛋白
SPA
‑5，其特征在于：所述耐碱突变蛋白
SPA
‑5在
A
结构域的基因序列为
SEQ ID NO.2。3.
根据权利要求1所述的耐碱突变蛋白
SPA
‑5，其特征在于：耐碱突变蛋白
SPA
‑5包括至少
70
％的
SEQ ID NO.1
的序列
。4.
根据权利要求1所述的耐碱突变蛋白
SPA
‑5，其特征在于：耐碱突变蛋白
SPA
‑5包括至少
80
％的
SEQ ID NO.1
的序列
。5.
根据权利要求1所述的耐碱突变蛋白
SPA
‑5，其特征在于：耐碱突变蛋白
SPA
‑5包括至少
95
％的
SEQ ID NO.1
的序列
。6.
一种如权利要求1‑5所述的耐碱蛋白的构建方法：包括以下步骤：
S1.
获取
SPA 11
蛋白表达前体载体，并以
SPA 11
蛋白表达前体载体作为
PCR
的模板；
S2.
获取六种设计引物，分别为
DomainA F1'、DomainA R1'、DomainA F2'、DomainA R2'、DomainA F3'、DomainA R3'。S3.
将六中设计引物和模板进行第一
PCR
处理
、
第一酶切处理
、
第一
T4
连接处和第一培养处理得到质粒；
S4.
获取
DomainA F4'
和
DomainA R4'
，以
DomainA F4'
和
DomainA R4'
为引物，质粒为载体，进行第二
PCR
处理
、
第二酶切处理
、
第二
T4
连接处和第二培养处理得到耐碱蛋白
。7.
根据权利要求6所述的耐碱蛋白的构建方法，其特征在于：所述
DomainA F1'
的序列为：
SEQ ID NO.3
；所述
DomainA R1'
的序列为：
SEQ ID NO.4
；所述
DomainA F2'
的序列为：
SEQ ID NO.5
...

【专利技术属性】
技术研发人员：高振飞，钱永常，张科，来灿钢，
申请(专利权)人：浙江纽龙合成材料制造有限公司，
类型：发明
国别省市：