双模态适体生物传感器及其在检测赭曲霉毒素制造技术

本发明专利技术属于生物传感检测技术领域，具体公开一种双模态适体生物传感器及其在赭曲霉毒素

【技术实现步骤摘要】
双模态适体生物传感器及其在检测赭曲霉毒素A中的应用


[0001]本专利技术属于生物传感检测
，具体涉及一种双模态适体生物传感器及其在检测赭曲霉毒素
A
中的应用，更具体的涉及一种基于共价有机框架
Fe
‑
MIL
‑
88
和滚环扩增信号放大策略的双模态适体生物传感器用于赭曲霉毒素
A
的检测
。

技术介绍

[0002]赭曲霉毒素
A
（
OTA
）是谷物
、
坚果
、
葡萄
、
干果和葡萄酒等多种农产品和食品中常见的污染物，主要由曲霉属和青霉属的真菌产生
。OTA
会对脂质
、
蛋白质和
DNA
造成损害，对健康具有肾毒性
、
致癌性
、
遗传毒性和免疫毒性，被归类为人类潜在致癌物（
2B
组）
。
快速
、
高选择性和高灵敏地检测
OTA
是食品安全
、
质量监控和环境分析的需要
。
液相色谱法和质谱法是常用的
OTA
检测方法
。
然而，这些方法需要昂贵的仪器和设备，而且它们依赖于实验室条件，限制了其在即时检测
(POCT)
分析中的广泛应用
。
此外，许多报道的方法是单模读出，其可靠性容易受到工作人员和仪器的异常的影响
。
因此，构建一个高灵敏度
、
高选择性
、
双模式读出
、
易于实现的
OTA
检测分析平台，特别是
POCT
检测平台是非常必要的
。
[0003]利用核酸适配体作为识别元件，基于纳米技术的生物传感器实现玉米中
OTA
快速检测是的一种良好选择
。
电化学生物传感器以其高灵敏度
、
低成本和易于携带等优点为临床诊断提供了一种可靠的替代方案
。
特别是随着电化学装置的小型化和智能化的发展，电化学生物传感器在临床诊断和
POCT
中具有重要的应用价值
。
值得注意的是，在电化学传感器中，选择稳定
、
无干扰的信号探头尤为重要
。
目前，二茂铁
(Fc)、
亚甲基蓝
(MB)
等几种经典的电活性有机小分子主要被用作电化学信号指示器
。
但是，它们很容易从电极表面脱落
。
为了解决上述问题，一种流行的策略是将信号分子
(
如
MB
或
Fc)
共轭在寡核苷酸上，构建寡核苷酸辅助的比例传感，这无疑会造成操作复杂和成本高的问题
。
此外，电活性有机小分子不仅难以固定，而且电活性不够强
。
[0004]金属有机框架材料（
MOF
）由通过多齿有机连接体相互连接的金属簇构成，由于其迷人的结构拓扑和有趣的特性，已显示出多种潜在应用
。
特别是，铁基
MOF
材料由于广泛存在的
Fe3‑
μ3‑
氧簇，在催化和光催化方面取得了显著成就，同时该材料兼具优异的电化学活性
。
本项目采用金属有机骨架材料
(Fe
‑
MIL
‑
88)
本身作为信号探头，电流信号强且稳定
。
结果表明，
Fe
‑
MIL
‑
88
不仅可以作为电化学信号探针，还可以作为催化四甲基联苯胺
(tetramethylbenzidine, TMB)
生成氧化
TMB
产物的纳米酶，避免了传统蛋白质在恶劣条件下成本高
、
储存条件严格
、
稳定性差的缺点
。
目前，科研人员已经探索了几种双模式检测方法，例如比色法
/
荧光法
、
比色法
/
磷光法和比色法
/
化学发光法等
。
在这些方法中，比色法已经成为一种经典的技术，因为它可以方便地用肉眼观察目标
。
由于用于
Fe
‑
MIL
‑
88
物质的多个信号读数，可以构建比色可视和电化学的双模式传感策略用于
OTA
的检测
。
[0005]由于
OTA
的浓度一般很低，因此采用信号扩增的方法是非常有必要的
。
滚环扩增（
RCA
）是一种强大的等温
DNA
复制工具，具有高灵敏度和简单的优点，可以自主合成具有串联重复序列的长单链序列
。
在合理设计的基础上，许多基于
RCA
的策略已被广泛应用于
DNA、
RNA、
蛋白质和小分子的分析中
。
同时，由于它们的同质性，适体通常被整合到基于
RCA
的分析策略中，从而实现结构转换适体传感器
。
通常，在
RCA
扩增之前，扩增模板生产的准备是从线性
DNA
挂锁结扎开始的，通过设计圆形模板，可以在单链中生成数千个周期性的用户指定序列
。
此外，滚动助行器的所有基底都固定在传感表面上，不需要外部解离链来进一步驱动助行器运动
。
在此策略中，一个非常小的环状寡核苷酸（例如，长度为
25
‑
100
个核苷酸）充当
DNA
或 RNA
聚合酶的模板，产生长的重复产物链，作为环状序列的放大拷贝
。
同时结合短序列
DNA
与环状序列特定序列的互补，最终实现信号放大
。
[0006]基于此，本专利技术通过以具有过氧化物酶活性和电化学活性信号的
Fe
‑
MIL
‑
88
，结合
RCA
的信号放大策略，构建比色
/
电化学双模感应传感器，实现对
OTA
的高灵敏度检测
。
本项目开发了一种即插即用的方法，利用智能设备配置的电化学生物传感器，实现了对各种食品样品中
OTA
的灵敏
、
准确
、
快速检测，为
POCT
提供了一种简单
、
低成本
、
实用的方法
。
此外，
Fe
‑
MIL本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种滚环链复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将
10 μ
L 5.76 μ
mol/L primer probe
和
10 μ
L 5.76 μ
mol/L Padlock probe
混合，加入
20 μ
L
连接缓冲液
A
退火
3 min
，在室温下逐渐冷却
3 h;
（2）步骤（1）所得产物，加入
2 μ
L 5 U/
μ
L T4 DNA
连接酶，在
37 ℃
下反应
3 h
，使得
Padlock probe
链闭合起来；（3）然后加入
5 μ
L 10 mmol/L dNTP、5 μ
L 10 U/
μ
L Phi29 DNA
聚合酶和
20 μ
L
缓冲溶液
B
，在
37 ℃
条件下，进行
50 min
的滚环复制，然后在
75 ℃
条件下加热灭活终止反应，制得所需的产物；所述
Primer probe
序列如
SEQ ID NO
：3所示；所述
Padlock probe
序列如
SEQ ID NO
：4所示
。2.
根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中的缓冲溶液
B
由
50 mmol/L Tris HCl、10 mmol/L MgCl2、10 mmol/L (NH4)2SO4、4 mmol/L DTT
混合而成
。3.
根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，连接缓冲液
A
由
5 mmol/L Tris HCl、1 mmol/L MgCl2、0.1 mmol/L ATP
和
1 mmol/L DTT
构成
。4.
一种双模态适体生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1
：
Au NPs@Fe
‑
MIL
‑
88/SA
复合物的制备；
S2
：传感器的制备，包括以下步骤：
S2
‑1：
10 μ
L 5 mg/mL
的氨基磁珠中加入
10 μ
L 0.5 mmol/L Sulfo
‑
SMCC
和
30 μ
L PBST
缓冲溶液，在
37 ℃
条件下震荡
2 h
；
S2
‑2：用
PBST
洗涤，弃去上层溶液，在氨基磁珠中加入
25 μ
L 5 μ
mol/L mDNA/OTA aptamer
双链复合物
、5 μ
L 100 mmol/L TCEP
和
20 μ
L PBST
缓冲溶液，在
37 ℃
条件下震荡过夜反应，所述
mDNA/OTA aptamer
双链复合物由序列如
SEQ ID NO
：2所示的
mDNA 和序列如
SEQ ID NO
：1所示的
OTA aptamer
等浓度等比例混合制备获得；
S2
‑3：用
PBST
洗涤，弃去上层溶液，在氨基磁珠中加入
1%BSA
震荡反应
30 min
以封闭活性位点；
S2
‑4：用
PBST
洗涤，弃去上层溶液，在氨基磁珠中加入
10 μ
L OTA 和
40 μ
L PBST
缓冲溶液，在
37 ℃
条件下震荡
1 h
；
S2
‑5：用
PBST
洗涤，弃去上层溶液，在氨基磁珠中加入
50 μ
L 2.78 μ
mol/L
滚环链复合物，在
37 ℃
条件下震荡
2 h
，所述滚环链复合物由权利要求1‑3任一制备方法制备获得；
S2
‑6：用
PBST
洗涤，弃去上层溶液，在氨基磁珠中加入
10 μ
L Au NPs@Fe
‑
MIL
‑
88/SA
复合物和
40 μ
L PBST
缓冲溶液，在
37 ℃
条件下震荡
2 h
；
S2
‑7：反应结束用
PBST
洗涤，弃去上层溶液，加入
10 μ
L 0.005 g/mL
壳聚糖与氨基磁珠均匀混合以后，即获得双模态适体生物传感器
。5.
根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述
PBST
缓冲溶液由
137 mmol/L NaCl
，
2...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡蓉，李玉龙，钟读波，杨云慧，杨通，李向楠，卞家亭，胡丽，尚延伟，
申请(专利权)人：云南师范大学，
类型：发明
国别省市：