卵巢交界性肿瘤类器官模型的构建方法技术

本发明专利技术涉及生化领域，具体公开了卵巢交界性肿瘤类器官模型的构建方法；本发明专利技术通过采集多个患者来源的新鲜肿瘤组织，然后在体外一致稳定的环境下建立多个模型，且模型囊性扩张

【技术实现步骤摘要】
卵巢交界性肿瘤类器官模型的构建方法


[0001]本专利技术属于生化
，具体涉及卵巢交界性肿瘤类器官模型的构建方法，

技术介绍

[0002]交界性卵巢肿瘤
(BOT)
是介于卵巢良恶性之间的一类特殊肿瘤，对传统化疗方案不敏感，由于缺乏代表性的细胞系，致使靶向药物的开发受到限制
。
[0003]类器官培养技术可以使通常来自干细胞的单细胞在体外三维
(3D)
环境中生长成小簇，在此环境中，分散的细胞自组装并分化为功能细胞簇
。
与传统的二维模型相比，肿瘤类器官能够更好地再现原代组织的细胞遗传特征
、
结构和功能
。
因此，类器官模型被广泛应用于抗肿瘤药物发现和个体化药物开发等转化应用研究中
。
需要注意的是肿瘤细胞经历极端的复制应激，容易发生基因组损伤，通常导致
DNA
双链断裂
(DSBs)
，而肿瘤细胞修复
DSB
常常使用同源重组修复或非同源末端连接修复通路r/>。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
卵巢交界性肿瘤类器官模型的构建方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
S1、
将新鲜的卵巢交界性肿瘤组织样本被切成
1—2
毫米的碎片，然后用冰冷的
PBS
冲洗血液，并尽可能多地去除脂肪和坏死组织；收集适当的组织包埋冰冻切片以供病理染色，剩余的样品用分散酶
ll(1U/ml)
在
37℃
下消化约
30
分钟，需要注意的是在消化过程中建议每隔1‑2分钟取少量上清液观察细胞团大小，以
10
‑
20
个细胞团为佳，消化完成后，加入
20
倍体积的洗涤液以稀释消化酶，室温静置3分钟以沉淀大块未消化组织，收集含细胞团的培养液后，在收集消化液后，可继续加入分散酶
II
，继续在
37℃
状态下消化组织以获得更多的细胞团，用
70
μ
M
细胞筛过滤培养液，用
1640
细胞培养液冲洗细胞筛上的细胞团以弃红细胞等单细胞，得到初始类器官腺体，收集初级类器官腺体，将其包埋在
70
％的基质胶中，并在
48
孔板中接种，并放置于
37
度培养箱中固化基质胶，加入生长培养基继续培养，类器官每3天用新鲜培养基替换，每2‑3周传代一次；
S2、
类器官的换液与传代，弃
48
孔板中的类器官培养液，从
48
孔板边缘小心加入
500
μ
l PBS
液洗涤培养孔，弃洗涤液后，加入
300
μ
l
新鲜培养液继续培养，待类器官汇合度达到
70
％以上时进行传代，传代时弃培养液，加入
200
μ
l
洗涤液，使用
P1000
枪头将包含类器官的基质胶划破，枪头多次吹打基质胶及类器官，将类器官吹打破碎至
20
细胞团大小，收集类器官液后离心获得类器官碎片，加入
70
％基质胶后将类器官种植于
48
孔板中，放置于
37
度培养箱固化基质胶后，添加培养液继续培养；
S3、
类器官用冰冷的
PBS
洗涤，然后加入细胞回收液消化基质胶，经离心分离类器官，用4％多聚甲醛固定后，将类器官在
30
％蔗糖溶液中脱水
24
小时，然后将其包埋在
0.C.T
冰凝胶中用于切片，切片用二甲苯和梯度乙醇处理，用柠檬酸缓冲液修复抗原，类器官被通透和封闭，加入相应的一抗和荧光标记的二抗后，对细胞核进行染色，载玻片经中性树脂固定后，在荧光显微镜下拍照观察；
S4、
在
48
孔板中培养
48h
后，将1‑
50
μ
M
的
Bractoppin
添加到类器官中再培养两天，类器官培养基中加入
20ulXTT/PMS
继续培养2小时，在使用酶标仪评估类器官的活力后，计算了几种类器官的半抑制浓度值，用细胞
3D
活死病检测试剂盒对类器官进行染色，活细胞和死细胞分别被标记为绿色和红色，并用荧光显微镜拍照；
S5、
将
Bractoppin
溶解于无菌水中，得到
10mM
原液，分装后，溶液
‑
80
°
贮存，使用时稀释至相应的工作浓度；
S6、
蛋白提取和蛋白印迹细胞在
RIPA
蛋白裂解缓冲液中完全裂解，然后离心获得蛋白溶液，测定蛋白浓度后，加入
LDS
缓冲液，加热变性，使用
SDS
‑
PAGE
凝胶分离蛋白质，转移到膜上，封闭，与一抗和二抗孵育，用
ECL
发光溶液开发，并拍照；
S7、
细胞培养和
CCK8
分析
H8910
和
SKOV3
细胞在含
10
％胎牛血清中...

【专利技术属性】
技术研发人员：程文俊，张林，姜旖，万一聪，周树林，孟黄洋，
申请(专利权)人：江苏省人民医院南京医科大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：