淋巴细胞靶向慢病毒载体制造技术

本文提供了慢病毒载体，所述慢病毒载体包含突变的异源包膜蛋白

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】淋巴细胞靶向慢病毒载体
[0001]关于序列表的声明
[0002]与本申请相关的序列表以文本格式而不是纸质副本提供，并且据此以引用方式并入本说明书中
。
包含序列表的文本文件的名称是
930207_401WO_SEQUENCE_LISTING.txt。
文本文件为
158KB
，创建于
2022
年2月
25
日，并经由
EFS
‑
Web
以电子方式提交
。

技术介绍

[0003]慢病毒载体在基因修饰细胞疗法，特别是
T
细胞疗法中起关键作用
。
最近批准的
T
细胞疗法依赖于逆转录病毒载体以将治疗性分子
(
例如，嵌合抗原受体
(CAR))
转导到
T
淋巴细胞中
。
与
CAR T
细胞产生相关的风险是用转基因转导其他细胞类型
。
使用具有广泛细胞向性的整合载体
(
例如用
VSV
‑
G
包膜蛋白假型化的慢病毒载体
)
可带来严重但罕见的安全问题
。
附图说明
[0004]图1是适用于第三代
LVV
产生系统的辅助质粒的示意图
。
[0005]图
2A
至图
2B
描绘了图表
(
图
2A)
和
FACS
图
(
图
2B)
，示出携带突变
VSV
‑
G
包膜的慢病毒载体中靶和脱靶进入
Jurkat T
细胞和
Raji B
细胞以破坏
LDL
受体结合
(Trop
‑
002、Trop
‑
051、Trop
‑
052、Trop
‑
055
和
Trop
‑
061)
和
T
细胞靶向蛋白
CD80。
在图
2A
中，左侧条柱是每个样本的中靶进入，而右侧条柱是脱靶进入
。T
细胞靶向蛋白与其在
T
细胞上的同源配体的结合导致慢病毒载体进入，测量报告绿色荧光蛋白
(GFP)
的后续表达
。
[0006]图
3A
至图
3B
描绘了示出以下的图：
(
图
3A)
由
VSV
‑
G
包装质粒表达的
T
细胞靶向蛋白
CD80
以与
HEK293
生产细胞表面上的突变
VSV
‑
G
相对等同的水平表达；并且
(
图
3B)
用该方法生成的
LVV
可以转导靶向的
Jurkat T
细胞，但不转导
Raji B
细胞
。
[0007]图4描绘了示出以下的图：
(
顶行
)
使用通过将
CD80
靶向蛋白克隆到
Rev
包装质粒或突变的
VSV
‑
G
包装质粒中而生成的
LVV
，
HEK293T
生产细胞表面上
CD80
和突变的
VSV
‑
G
的表达水平；
(
底行
)
通过将
CD80
靶向蛋白克隆到
Rev
包装质粒或突变的
VSV
‑
G
包装质粒中而生成的
LVV
转导靶向的
Jurkat T
细胞
。
[0008]图5描绘了
(
左
)
使用五质粒包装体系的
HEK293T
生产细胞表面上的
CD80
靶向蛋白表达作为
CD80
质粒浓度的函数；以及
(
右
)
用五质粒包装体系生成的
LVV
转导靶向的
Jurkat T
细胞，并且转导效率与
CD80
包装质粒浓度相关
。
[0009]图
6A
至图
6D
描绘了在贴壁
HEK293
或悬浮
HEK293
生产细胞中产生的靶向
LVV
的淋巴细胞的滴度
。
通过离心
(
图
6A)
或通过阴离子交换色谱法后接切向流过滤
(
图
6B)
从
HEK293
贴壁细胞培养基收获
LVV。
通过阴离子交换色谱法从
HEK293
悬浮细胞培养基收获
LVV(
图
6C)。
通过
AEX/TFF
浓缩得到具有高纯度和回收率水平的
LVV
制剂
(
图
6D)。
[0010]图7描绘了用包含
BCMA CAR
转基因的
LVV
或包含
BCMA CAR
转基因的靶向
LVV
的
T
细胞
(
抗
CD3
和
CD80)
测试来自健康人供体的
PBMC
中的
T
细胞转导的示意图
。
右下方示出的图表明，即使在低
MOI
下，靶向
LVV
的
T
细胞以比标准
LVV
更高的水平转导
T
细胞，并且与标准
LVV
不
同，靶向
LVV
的
T
细胞能够在不存在
IL
‑2和外源性激活抗体
(
抗
CD3
和抗
CD28)
的情况下转导
T
细胞
。
[0011]图8描绘了示出在存在或不存在外源性激活抗
CD3
和抗
CD28
抗体的情况下，从获自三个不同供体并使用标准
LVV
或
T
细胞重定向的
LVV(
抗
CD3
和
CD80)
转导的
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.
一种慢病毒载体，所述慢病毒载体包括：
(a)
病毒包膜，所述病毒包膜包含：异源淋巴细胞靶向蛋白，所述淋巴细胞靶向蛋白包含：胞外结构域，所述胞外结构域包含淋巴细胞靶向结构域；和跨膜结构域；和
(b)
突变的
VSV
‑
G
包膜蛋白，所述突变的
VSV
‑
G
包膜蛋白表现出与
LDL
‑
R
的结合被抑制但介导膜融合；和
(c)
表达盒，所述表达盒包含异源转基因
。2.
根据权利要求1所述的慢病毒载体，其中所述异源淋巴细胞靶向蛋白是包含含
T
细胞靶向结构域的胞外结构域的异源
T
细胞靶向蛋白
。3.
根据权利要求1所述的慢病毒载体，其中所述异源淋巴细胞靶向蛋白是包含含
NK
细胞靶向结构域的胞外结构域的异源自然杀伤
(NK)
细胞靶向蛋白
。4.
根据权利要求1所述的慢病毒载体，其中所述异源淋巴细胞靶向蛋白是包含含
B
细胞靶向结构域的胞外结构域的异源
B
细胞靶向蛋白
。5.
根据权利要求1或2所述的慢病毒载体，其中所述异源淋巴细胞靶向蛋白是异源
T
细胞靶向蛋白，所述异源
T
细胞靶向蛋白特异性结合至：
(a)T
细胞标志物，其选自
CD3、CD28、CD80、4
‑
1BB、AhR、CD3、CD2、CD7、CD4、CD8、CD25、CD44、CD45RA、CD47、CD62L、CD69、CD94、CD95、CD127、CD161、CD183(CXCR3)、CD184(CXCR4)、CD185(CXCR5)、CD193(CCR3)、CD194(CCR4)、CD195(CCR5)、CD196(CCR6)、CD197(CCR7)、CCR10、PD
‑
1、TCRa/b、CD5、CD27、CD45RO、CD45RB、CD57、CD103、CD122、P2RX7、TIGIT、LAG
‑
3、TIM
‑3和
IL6ST
，或其任何组合；
(b)
γδ
T
细胞标志物，其选自
γδ
TCR、V
δ
1、V
δ2和
NKG2D(KLRK1、CD314)
；
(c)NK T
细胞标志物，其选自恒定
TCR(Va24
‑
Ja18)、CD185(CXCR5)、CXCR6
和
IL
‑
21R
，或其任何组合；或者
(d)MAIT
细胞标志物，其选自
Va7.2、Ja33、CXCR6、IL
‑
18R、KLRB1(CD161)
和
VLA4(
α4β1整合素
)
或其任何组合
。6.
根据权利要求
1、2
或5所述的慢病毒载体，其中所述异源淋巴细胞靶向蛋白是包含胞外结构域的异源
T
细胞靶向蛋白，所述胞外结构域包含特异性结合至
CD3
蛋白或
CD28
蛋白的
T
细胞靶向结构域
。7.
根据权利要求1或3所述的慢病毒载体，其中所述异源淋巴细胞靶向蛋白是特异性结合至
NK
细胞标志物的异源
NK
细胞靶向蛋白，所述
NK
细胞标志物选自
CD56、NKp46、CD16、KIR(s)、NKG2
蛋白
(
例如，
NKG2D(KLRK1、CD314))、KLRB1(CD161)、KLRD1(cd94)、IL2Rb(CD122)、IL
‑
21R、SLAMF6(CD352)、SLAMF7(CD319)
和
IL
‑
18R
，或其任何组合
。8.
根据权利要求1或4所述的慢病毒载体，其中所述异源淋巴细胞靶向蛋白是特异性结合至
B
细胞标志物的
B
细胞靶向蛋白，所述
B
细胞标志物选自
CD19、CD20、CD21、CD22、CD24、CD38、CD40、CD72、CD32b、CD268、CD269、CD267、CD86、CD80、CD52、CD138、CD27、CD28、CD23、CD84、CD257、CD270、CD37、CD74
和
CD269
，或其任何组合
。9.
根据权利要求
1、2、5
和6中任一项所述的慢病毒载体，其中所述靶向蛋白包含
CD80
蛋白，所述
CD80
蛋白包含与
SEQ ID NO:6
具有至少约
75
％
、80
％
、85
％
、90
％
、91
％
、92
％
、93
％
、
94
％
、95
％
、96
％
、97
％
、98
％
、99
％
、99.5
％或
100
％同一性的胞外结构域
。10.
根据权利要求
1、2、5、6
和9中任一项所述的慢病毒载体，其中所述靶向蛋白包含
CD80
蛋白，所述
CD80
蛋白包含与
SEQ ID NO:8
具有至少约
75
％
、80
％
、85
％
、90
％
、91
％
、92
％
、93
％
、94
％
、95
％
、96
％
、97
％
、98
％
、99
％
、99.5
％或
100
％同一性的跨膜和胞内结构域
。11.
根据权利要求
1、2、5、6、9
或
10
所述的慢病毒载体，其中所述靶向蛋白包含
CD80
蛋白，所述
CD80
蛋白包含
SEQ ID NO:2
或不存在
SEQ ID NO:4
的信号肽的
SEQ ID NO:2。12.
根据权利要求
1、2、5
和6中任一项所述的慢病毒载体，其中所述靶向蛋白包含抗
CD3 scFv
，所述抗
CD3 scFv
具有与
SEQ ID NO:14
具有至少约
75
％
、80
％
、85
％
、90
％
、91
％
、92
％
、93
％
、94
％
、95
％
、96
％
、97
％
、98
％
、99
％
、99.5
％或
100
％同一性的轻链可变区和与
SEQ ID NO:18
具有至少约
75
％
、80
％
、85
％
、90
％
、91
％
、92
％
、93
％
、94
％
、95
％
、96
％
、97
％
、98
％
、99
％
、99.5
％或
100
％同一性的重链可变区
。13.
根据权利要求
12
所述的慢病毒载体，其中所述靶向蛋白包含抗
CD3
靶向蛋白，所述抗
CD3
靶向蛋白包含：
(i)SEQ ID NO:10
或不存在
SEQ ID NO:12
的信号肽的
SEQ ID NO:10
；或者
(ii)SEQ ID NO:117
或不存在
SEQ ID NO:12
的信号肽的
SEQ ID NO:117。14.
根据任一前述权利要求所述的慢病毒载体，其中如在宿主细胞中表达的所述靶向蛋白包含信号序列
。15.
根据任一前述权利要求所述的慢病毒载体，其中所述成熟靶向蛋白缺乏信号序列
。16.
根据权利要求1‑
14
中任一项所述的慢病毒载体，其中所述成熟靶向蛋白包含至少一个来自信号序列的氨基酸
。17.
根据任一前述权利要求所述的慢病毒载体，其中所述突变的
VSV
‑
G
包膜蛋白包含选自以下各项中的一个或多个的突变：
H8、N9、Q10、K47、K50、A51、S183、S179、N180、I182、M184、Y209、I347、T350、T352、E353
和
R354
处的突变；
N9
与
Q10
之间的
TT
插入
、H8
与
N9
之间的
GGS
插入
、N9
与
Q10
之间的
GGS
插入
、N208
与
Y209
之间的
TT
插入
、P46
与
K47
之间的
GGS
插入
、
以及
N208
与
Y209
之间的
GGS
插入；以及残基1‑8的缺失
。18.
根据任一前述权利要求所述的慢病毒载体，其中所述突变的
VSV
‑
G
包膜蛋白包含选自以下各项中的两个或更多个的突变：
H8、N9、Q10、K47、K50、A51、S183、S179、N180、I182、M184、Y209、I347、T350、T352、E353
和
R354
处的突变；
N9
与
Q10
之间的
TT
插入
、H8
与
N9
之间的
GGS
插入
、N9
与
Q10
之间的
GGS
插入
、N208
与
Y209
之间的
TT
插入
、P46
与
K47
之间的
GGS
插入
、
以及
N208
与
Y209
之间的
GGS
插入；以及残基1‑8的缺失
。19.
根据任一前述权利要求所述的慢病毒载体，其中所述突变的
VSV
‑
G
包膜蛋白包含选自
H8A、N9A、Q10A、K47A、K47Q、N180A、I182A、Y209A、T352A、T352W、E353A、R354A
和
R354Q
中的一者或多者的突变
。20.
根据任一前述权利要求所述的慢病毒载体，其中所述突变的
VSV
‑
G
包膜蛋白包含选自
H8A、K47A、K47Q、Y209A、R354A
和
R354Q
中的一者或多者的突变
。
21.
根据前述权利要求中任一项所述的慢病毒载体，其中所述突变的
VSV
‑
G
包膜蛋白包含：
(a)K47
突变和
R354
突变；
(b)N180
突变
、I182
突变
、T352
突变和
E353
突变；
(c)T352
突变和
E353
突变；
(d)N9
突变
、Q10
突变和
N180
突变；或者
(e)H8
与
N9
之间的
GGS
插入和
N9
与
Q10
之间的
GGS
插入；
(f)N9
与
Q10
之间的
TT
插入；或者
(g)P46
与
K47
之间的
GGS
插入
。22.
根据权利要求
21
所述的慢病毒载体，其中所述突变的
VSV
‑
G
包膜蛋白包含：
(a)K47Q
突变和
R354A
突变；
(b)N180A
突变
、I182A
突变
、T352A
突变和
E353A
突变；
(c)T352W
突变和
E353A
突变；或者
(d)N9A
突变
、Q10A
突变和
N180A
突变
。23.
根据前述权利要求中任一项所述的慢病毒载体，其中所述突变的
VSV
‑
G
包膜蛋白包含
SEQ ID NO:74、93、95、97、99
和
103
中任一者的氨基酸序列
。24.
根据任一前述权利要求所述的慢病毒载体，其中所述异源转基因编码嵌合抗原受体
(CAR)
，所述嵌合抗原受体包含：胞外结构域，所述胞外结构域包含特异性结合至靶分子的结合结构域；胞内信号传导结构域，其中所述胞内信号传导结构域包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序
(ITAM)
和任选的共刺激信号传导结构域；以及跨膜结构域，所述跨膜结构域连接所述胞外结构域和所述胞内信号传导结构域
。25.
根据权利要求
24
所述的慢病毒载体，其中由所述转基因编码的所述
CAR
包含：
(a)
结合结构域，所述结合结构域特异性结合
CD19、BCMA、
α
叶酸受体
、5T4、Ab
整合素
、B7
‑
H3、B7
‑
H6、CAIX、CD20、CD22、CD23、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD52、CD70、CD79a、CD79b、CD80、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、ErbB2(HER2)、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EpCAM、FAP、
胎儿
AchR、FLT3、Fra、GD2、GD3、
磷脂酰肌醇蛋白聚糖
3(GPC3)、HLA
‑
A1+MAGE1、HLA
‑
A2+MAGE1、HLA
‑
A3+MAGE1、HLA
‑
A1+NY
‑
ESO
‑
1、HLA
‑
A2+NY
‑
ESO
‑
1、HLA
‑
A3+NY
‑
ESO
‑
1、HLADR、IL
‑
11Ralpha、IL
‑
13Ralpha2、Lambda、Lewis
‑
Y、Kappa、
间皮素
、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2d
配体
、NY
‑
ESO
‑
1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、
存活素
、TAG72、TEM、VEGFR2、BAFF
‑
R、
紧密连接蛋白
18.2、CD86、FcRL5、GPRC5
和
TACI
中的一者或多者；
(b)
跨膜结构域，所述跨膜结构域选自
CD28、CD2、CD4、CD8a、CD5、CD3
ε
、CD3
δ
、CD3
ζ
、CD9、CD16、CD22、CD25、CD27、CD33、CD37、CD40、CD45、CD64、CD79A、CD79B、CD80、CD86、CD95(Fas)、CD134(OX40)、CD137(4
‑
1BB)、CD150(SLAMF1)、CD152(CTLA4)、CD154(CD40L)、CD200R、CD223(LAG3)、CD270(HVEM)、CD272(BTLA)、CD273(PD
‑
L2)、CD274(PD
‑
L1)、CD278(ICOS)、CD279(PD
‑
1)、CD300、CD357(GITR)、A2aR、DAP10、FcR
α
、FcR
β
、FcR
γ
、Fyn、GAL9、KIR、Lck、LAT、LRP、NKG2D、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、PTCH2、ROR2、Ryk、Slp76、SIRP
α
、pT
α
、TCR
α
、TCR
β
、TIM3、TRIM、LPA5
和
Zap70
跨膜结构域；
(c)
胞内信号传导结构域，所述胞内信号传导结构域选自
CD3
γ
、CD3
δ
、CD3
ε
、CD3
ζ
、CD5、CD22、CD79a、CD278(ICOS)、DAP10、DAP12、FcR
γ
和
CD66d
结构域；
(d)
共刺激结构域，所述共刺激结构域选自
CD27、CD28、CD40L、GITR、NKG2C、CARD1、CD2、CD7、CD27、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX
‑
40)、CD137(4
‑
1BB)、CD150(SLAMF1)、CD152(CTLA4)、CD223(LAG3)、CD226、CD270(HVEM)、CD273(PD
‑
L2)、CD274(PD
‑
L1)、CD278(ICOS)、DAP10、LAT、LFA
‑
1、LIGHT、NKG2C、NKD2C、SLP76、TRIM
和
ZAP70
结构域中的一者或多者；以及
(e)
任选的胞外非信号传导接头结构域，所述非信号传导接头结构域位于所述结合结构域与所述跨膜结构域之间，其中所述非信号传导接头结构域选自：
(i)
免疫球蛋白铰链区，所述免疫球蛋白铰链区选自野生型或经修饰的
IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA
和
IgD
铰链区；
(ii)
铰链区，所述铰链区选自野生型或经修饰的
CD8a、CD4、CD28
和
CD7
铰链区；
(iii)Fc
结构域的全部或一部分，所述
Fc
结构域选自
CH1
结构域
、CH2
结构域和
CH3
结构域中的一者或多者；以及
(iv)II
型
C
‑
凝集素的茎区，其来源于
CD23、CD69、CD72、CD94、NKG2A
和
NKG2D
的茎区
。26.
根据权利要求
24
或
25
中任一项所述的慢病毒载体，其中由所述转基因编码的所述
CAR
是抗
CD19 CAR
，其包含：包含抗
CD19 scFv
的结合结构域，所述抗
CD19 scFv
包含与
SEQ ID NO:46
具有至少约
75
％
、80
％
、85
％
、90
％
、91
％
、92
％
、93
％
、94
％
、95
％
、96
％
、97
％
、98
％
、99
％
、99.5
％或
100
％同一性的轻链可变区和与
SEQ ID NO:50
具有至少约
75
％
、80
％
、85
％
、90
％
、91
％
、92
％
、93
％
、94
％
、95
％
、96
％
、97
％
、98
％
、99
％
、99.5
％或
100
％同一性的重链可变区；
CD8a
铰链和跨膜结构域，其与
SEQ ID NO:52
具有至少约
75
％
、80
％
、85
％
、90
％
、91
％
、92
％
、93
％
、94
％
、95
％
、96
％
、97
％
、98
％
、99
％
、99.5
％或
100
％同一性；
CD3
ζ
效应结构域，其与
SEQ ID NO:56
具有至少约
75
％
、80
％
、85
％
、90
％
、91
％
、92
％
、93
％
、94
％
、95
％
、96
％
、97
％
、98
％
、99
％
、99.5
％或
100
％同一性；以及4‑
1BB
共刺激结构域，其与
SEQ ID NO:54
具有至少约
75
％
、80
％
、85
％
、90
％
、91
％
、92
％
、93
％
、94
％
、95
％
、96
％
、97
％
、98
％
、99
％
、99.5
％或
100
％同一性
。27.
根据权利要求
26
所述的慢病毒载体，其中由所述转基因编码的所述
CAR
包含
SEQ ID NO:42
或不存在
SEQ ID NO:44
的信号肽的
SEQ ID NO:42。28.
根据权利要求
24
或
25
中任一项所述的慢病毒载体，其中由所述转基因编码的所述
CAR
是抗
BCMACAR
，其包含：包含抗
BCMA scFv
的结合结构域，所述抗
BCMA scFv
包含与
SEQ ID NO:62
具有至少约
75
％
、80
％
、85
％
、90
％
、91
％
、92
％
、93
％
、94
％
、95
％
、96
％
、97
％
、98
％
、99
％
、99.5
％或
100
％同一性的轻链可变区和与
SEQ ID NO:66
具有至少约
75
％
、80
％
、85
％
、90
％
、91
％
、92
％
、93
％
、94
％
、95
％
、96
％
、97
％
、98
％
、99
％
、99.5
％或
100
％同一性的重链可变区；
CD8a
铰链和跨膜结构域，其与
SEQ ID NO:52
具有至少约
75
％
、80
％
、85
％
、90
％
、91
％
、92
％
、93
％
、94
％
、95
％
、96
％
、97
％
、98
％
、99
％
、99.5
％或
100
％同一性；
CD3
ζ
效应结构域，其与
SEQ ID NO:122
具有至少约
75
％
、80
％
、85
％
、90
％
、91
％
、92
％
、93
％
、94
％
、95
％
、96
％
、97
％
、98
％
、99
％
、99.5
％或
100
％同一性；以及4‑
1BB
共刺激结构域，其与
SEQ ID NO:54
具有至少约
75
％
、80
％
、85
％
、90
％
、91
％
、92
％
、93
％
、94
％
、95
％
、96
％
、97
％
、98
％
、99
％
、99.5
％或
100
％同一性
。
29.
根据权利要求
26
所述的慢病毒载体，其中由所述转基因编码的所述
CAR
包含
SEQ ID NO:58
或不存在
SEQ ID NO:60
的信号肽的
SEQ ID NO:58。30.
一种用于产生根据前述权利要求中任一项所述的淋巴细胞靶向慢病毒载体的方法，所述方法包括：
(a)
用
GagPol
质粒
、Rev
质粒
、
转基因质粒和
VSV
‑
G env
质粒转染生产细胞，其中；
(i)
所述
GagPol
质粒包含一种或多种编码慢病毒
gag
基因和慢病毒
pol
基因的多核苷酸，并且能够在所述生产细胞中表达慢病毒
Gag
多蛋白和慢病毒
Pol
多蛋白；
(ii)
所述
Rev
质粒包含编码慢病毒
rev
基因的多核苷酸，并且能够在所述生产细胞中表达慢病毒
Rev
蛋白；
(iii)
所述转基因质粒包含表达盒，所述表达盒包含编码
CAR
的多核苷酸；并且
(iv)
所述
VSV
‑
G env
质粒包含串联表达盒，其中所述串联表达盒包含编码突变的
VSV
‑
G
包膜蛋白的多核苷酸和编码淋巴细胞靶向蛋白的多核苷酸，并且所述
VSV
‑
G env
质粒能够在所述生产细胞内表达所述突变的
VSV
‑
G
包膜蛋白和所述淋巴细胞靶向蛋白；
(b)
在培养基中培养所述生产细胞；以及
(c)
从所述培养基中收获慢病毒载体
。31.
一种用于产生根据权利要求1‑
29
中任一项所述的淋巴细胞靶向慢病毒载体的方法，所述方法包括：
(a)
用
GagPol
质粒
、Rev
质粒
、
转基因质粒和
VSV
‑
G env
质粒转染生产细胞，其中；
(i)
所述
GagPol
质粒包含编码所述
Gag
多蛋白前体和
Pol
多蛋白前体和淋巴细胞靶向蛋白的串联表达盒，并且所述
GagPol
质粒能够在所述生产细胞内表达慢病毒
Gag
多蛋白
、
慢病毒
Pol
多蛋白和所述淋巴细胞靶向蛋白；
(ii)
所述
Rev
质粒包含编码慢病毒
rev
基因的多核苷酸，并且能够在所述生产细胞中表达慢病毒
Rev
蛋白；
(iii)
所述转基因质粒包含表达盒，所述表达盒包含编码
CAR
的多核苷酸；并且
(iv)
所述
VSV
‑
G env
质粒包含编码突变的
VSV
‑
G
包膜蛋白的多核苷酸，并且所述
VSV
‑
G env
质粒能够在所述生产细胞内表达所述突变的
VSV
‑
G
包膜蛋白；
(b)
在培养基中培养所述生产细胞；以及
(c)
从所述培养基中收获慢病毒载体
。32.
一种用于产生根据权利要求1‑
29
中任一项所述的淋巴细胞靶向慢病毒载体的方法，所述方法包括：
(a)
用
GagPol
质粒
、Rev
质粒
、
转基因质粒和
VSV
‑
G env
质粒转染生产细胞，其中；
(i)
所述
GagPol
质粒包含一种或多种编码慢病毒
gag
基因和慢病毒
pol
基因的多核苷酸，并且能够在所述生产细胞中表达慢病毒
Gag
多蛋白和慢病毒
Pol
多蛋白；
(ii)
所述
Rev
质粒包含串联表达盒，其中所述串联表达盒包含编码慢病毒
rev
基因的多核苷酸和编码淋巴细胞靶向蛋白的多核苷酸，并且所述
Rev
质粒能够在所述生产细胞内表达慢病毒
Rev
蛋白和所述淋巴细胞靶向蛋白；
(iii)
所述转基因质粒包含表达盒，所述表达盒包含编码
CAR
的多核苷酸；并且
(iv)
所述
VSV
‑
G env
质粒包含编码突变的
VSV
‑
G
包膜蛋白的多核苷酸，并且所述
VSV
‑
G env
质粒能够在所述生产细胞内表达所述突变的
VSV
‑
G
包膜蛋白；
(b)
在培养基中培养所述生产细胞；以及
(c)
从所述培养基中收获慢病毒载体
。33.
一种用于产生根据权利要求1‑
29
中任一项所述的淋巴细胞靶向慢病毒载体的方法，所述方法包括：
(a)
用
GagPol
质粒
、Rev
质粒
、
转基因质粒
、VSV
‑
G env
质粒和淋巴细胞靶向蛋白质粒转染生产细胞；
(i)
所述
GagPol
质粒包含一种或多种编码慢病毒
gag
基因和慢病毒
pol
基因的多核苷酸，并且能够在所述生产细胞中表达慢病毒
Gag
多蛋白和慢病毒
Pol
多蛋白；
(ii)
所述
Rev
质粒包含编码慢病毒
rev
基因的多核苷酸，并且能够在所述生产细胞中表达慢病毒
Rev
蛋白；
(iii)
所述转基因质粒包含表达盒，所述表达盒包含编码
CAR
的多核苷酸；并且
(iv)
所述
VSV
‑
G env
质粒包含编码突变的
VSV
‑
G
包膜蛋白的多核苷酸，并且能够在所述生产细胞中表达所述突变的
VSV
‑
G
包膜蛋白；并且
(v)
所述淋巴细胞靶向蛋白质粒包含编码淋巴细胞靶向蛋白的多核苷酸，并且能够在所述生产细胞内表达所述淋巴细胞靶向蛋白；
(b)
在培养基中培养所述生产细胞；以及
(c)
从所述培养基中收获慢病毒载体
。34.
根据权利要求
30
‑
33
中任一项所述的方法，其中由所述淋巴细胞靶向蛋白质粒编码的所述淋巴细胞靶向蛋白是
T
细胞靶向蛋白
。35.
根据权利要求
30
‑
33
中任一项所述的方法，其中由所述淋巴细胞靶向蛋白质粒编码的所述淋巴细胞靶向蛋白是
NK
细胞靶向蛋白
。36.
根据权利要求
30
‑
33
中任一项所述的方法，其中由所述淋巴细胞靶向蛋白质粒编码的所述淋巴细胞靶向蛋白是
B
细胞靶向蛋白
。37.
根据权利要求
30
‑
33
和
34
中任一项所述的方法，其中由所述淋巴细胞靶向蛋白质粒编码的所述淋巴细胞靶向蛋白是特异性结合至以下各项的
T
细胞靶向蛋白：
(a)T
细胞标志物，所述
T
细胞标志物选自
CD3、CD28、CD80、4
‑
1BB、AhR、CD3、CD2、CD7、CD4、CD8、CD25、CD44、CD45RA、CD47、CD62L、CD69、CD94、CD95、CD127、CD161、CD183(CXCR3)、CD184(CXCR4)、CD185(CXCR5)、CD193(CCR3)、CD194(CCR4)、CD195(CCR5)、CD196(CCR6)、CD197(CCR7)、CCR10、PD
‑
1、TCRa/b、CD5、CD27、CD45RO、CD45RB、CD57、CD103、CD122、P2RX7、TIGIT、LAG
‑
3、TIM
‑3和
IL6ST
，或其任何组合；
(b)
γδ
T
细胞标志物，其选自
γδ
TCR、V
δ
1、V
δ2和
NKG2D(KLRK1、CD314
或其任何组合
)
；
(c)NK T
细胞标志物，其选自恒定
TCR(Va24
‑
Ja18)、CD185(CXCR5)、CXCR6
和
IL
‑
21R
，或其任何组合；或者
(d)MAIT
细胞标志物，其选自
Va7.2、Ja33、CXCR6、IL
‑
18R、KLRB1(CD161)
和
VLA4(
α4β1整合素
)
或其任何组合
。38.
根据权利要求
37
所述的方法，其中所述靶向蛋白包含
CD80
蛋白，所述
CD80
蛋白包含与
SEQ ID NO:6
具有至少约
75
％
、80
％
、85
％
、90
％
、91
％
、92
％
、93
％
、94
％
、95
％
、96
％
、97
％
、98
％
、99
％
、99.5
％或
100
％同一性的胞外结构域
。39.
根据权利要求
37
和
38

【专利技术属性】
技术研发人员：莫莉，
申请(专利权)人：凯洛尼亚疗法有限公司，
类型：发明
国别省市：