新型制造技术

本发明专利技术提供了新型

【技术实现步骤摘要】
新型HPV广谱抗原的制备及其多克隆卵黄抗体的应用


[0001]本专利技术涉及
HPV
治疗
，更具体地，涉及新型
HPV
广谱抗原的制备及其多克隆卵黄抗体的应用
。

技术介绍

[0002]宫颈癌是全世界范围内常见的女性恶性肿瘤
。
持续感染高危型人乳头瘤病毒（
HPV
）是发生宫颈癌的明确危险因素
。HPV
至今已鉴定明确的大约有
200
多个亚型，根据其致病和预后不同又可分为高危型
HPV(HR
‑
HPV)
和低危型
HPV(LR
‑
HPV)
，其中
HR
‑
HPV 15
种，包括
HR
‑
HPV16、18、31、33、35、39、45、5l、52、56、53、58
型等，感染后可引起癌前病变和宫颈癌
。
[0003]卵黄抗体
(Immunoglobulin of yolk ,IgY)
是指特定抗原刺激禽类Ｂ淋巴细胞，由Ｂ细胞分化成浆细胞并由此分泌特异性抗体进入血液循环，当血液流经卵巢时在卵细胞中逐渐蓄积，形成卵黄抗体
。DNA
核酸抗原肌肉注射免疫产蛋鸡所获得的卵黄抗体
(IgY)
的生物活性远超一般技术
(
皮下注射蛋白抗原
)
制备的卵黄抗体，抗体效价更高，特异性更强/>。
卵黄抗体具有性质稳定
、
特异性强
、
制备成本低
、
口服安全等优点在家禽
、
家畜传染病的防治中已得到广泛的应用
。
产品的开发也在生态农业和食品安全方面产生了良好的经济效益和社会效益
。
在诊断
、
预防和治疗人类和动物各种疾病中具有良好的应用价值
。

技术实现思路

[0004]针对现有技术所存在的技术问题，本专利技术提供了新型
HPV
广谱抗原的制备及其多克隆卵黄抗体的应用
。
本研究将
HPV16、HPV18、HPV6
和
HPV11
的
L1
抗原融合在一起得到
HPV
广谱抗原，以纯化的
HPV
广谱抗原直接免疫产蛋鸡，待抗体产生后，经过盐析
、
透析
、
以及浓缩等步骤纯化抗体
。
经验证，该多克隆卵黄抗体具备广谱的抗
HPV
活性，能有有效预防或治疗绝大多数常见的人乳头瘤病毒
(HPV)
感染，阻止因
HPV
病毒感染引起癌变的难题
。
[0005]具体而言，本专利技术首先是提供了一种新型
HPV
广谱抗原，该广谱抗原是
HPV16、HPV18、HPV6
和
HPV11
的
L1
抗原核心序列经多肽连接子融合得到的
。
[0006]优选地，多数多肽连接子包括 (GS)n、(GGGS)n
等
。
[0007]优选地，所述广谱抗原是通过
GSGS
多肽连接子将
HPV16、HPV18、HPV6
和
HPV11
的
L1
抗原核心序列进行串联
。
[0008]优选地，所述广谱抗原的氨基酸序列如
SEQ ID NO.1
‑3所示
。
[0009]优选地，所述广谱抗原的编码序列是经过密码子优化得到，进一步经密码子优化的编码序列如
SEQ ID NO.4
‑6所示
。
[0010]另一方面，本专利技术还提供了一种新型
HPV
广谱抗原的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：1）对
HPV16、HPV18、HPV6
和
HPV11
的
L1
抗原核心序列进行密码子优化，得到匹配的核苷酸序列；2）将步骤1）核苷酸序列通过酶切连接方式与原核表达载体进行偶联；
3
）将步骤2）的重组表达载体导入大肠杆菌中进行重组表达；4）挑选步骤3）中的重组大肠杆菌，进行摇瓶培养；5）收集步骤4）中的大肠杆菌，并进行重组蛋白提取和纯化，即可得到
HPV
广谱抗原
。
[0011]步骤1）中的核苷酸序列如
SEQ ID NO.4
‑6所示；步骤2）中的原核表达载体是选自
pET28a、pGEX
‑
4T、pET30
或
pColdII
等
。
[0012]步骤3）中的大肠杆菌选自
BL21(DE3)、Rosetta
或
OrigamiB
等
。
[0013]步骤4）中的摇瓶培养条件为挑取重组大肠杆菌单菌落加入
10ml LB
培养，
37℃300rpm
过夜培养
。
[0014]步骤5）中的重组蛋白提取和纯化步骤包括使用超声仪器将细菌悬液进行破碎处理，离心收集上清，将上清液通过亲和柱层析进行分离纯化，经洗脱和超滤浓缩即可得到由
HPV16、HPV18、HPV6
和
HPV11
的
L1
蛋白重组的
HPV
广谱抗原
。
[0015]进一步地，本专利技术还提供了一种基于新型
HPV
广谱抗原的多克隆卵黄抗体，其特征在于，所述多克隆卵黄抗体是经由所述新型
HPV
广谱抗原免疫产蛋鸡制备得到
。
[0016]进一步地，所述多克隆卵黄抗体的制备方法包括如下步骤：（1）根据所述的新型
HPV
广谱抗原的制备方法获取所述的新型
HPV
广谱抗原；（2）产蛋鸡免疫程序：初次免疫原为新型
HPV
广谱抗原
(500
µ
g) 加等体积弗氏完全佐剂
( Freunds complete adjuvant, FCA) 充分混匀成乳剂
, 常规碘酒
、
酒精消毒产蛋鸡胸部和翅膀下的6个点分布式肌内注射
1 ml 乳化液进行免疫
。
随后加强免疫的抗原为新型
HPV
广谱抗原
(250
µ
g) 加弗氏不完全佐剂
( Freunds incomplete adjuvant, FIA) 充分混匀间隔2周加强免疫2次
。
在加强免疫
1 周后，收集鸡蛋，
4 ℃
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种新型
HPV
广谱抗原，其特征在于，该广谱抗原是
HPV16、HPV18、HPV6
和
HPV11
的
L1
抗原核心序列经多肽连接子融合得到的
。2. 如权利要求1所述的新型
HPV
广谱抗原，其特征在于，多肽连接子包括 (GS)n、(GGGS)n
，其中
n
取值为1‑5之间的自然数
。3.
如权利要求2所述的新型
HPV
广谱抗原，其特征在于，所述广谱抗原是通过
GSGS
多肽连接子将
HPV16、HPV18、HPV6
和
HPV11
的
L1
抗原核心序列进行串联
。4. 如权利要求1‑3任一项所述的新型
HPV
广谱抗原，其特征在于，所述广谱抗原的氨基酸序列如
SEQ ID NO.1
‑3所示
。5. 如权利要求4所述的新型
HPV
广谱抗原，其特征在于，所述广谱抗原的编码序列是经过密码子优化得到，经密码子优化的编码序列如
SEQ ID NO.4
‑6所示
。6.
权利要求1‑5任一项所述的新型
HPV
广谱抗原的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：1）对
HPV16、HPV18、HPV6
和
HPV11
的
L1
抗原核心序列进行密码子优化，得到匹配的核苷酸序列；2）将步骤1）核苷酸序列通过酶切连接方式与原核表达载体进行偶联；3）将步骤2）的重组表达载体导入大肠杆菌中进行重组表达；4）挑选步骤3）中的重组大肠杆菌，进行摇瓶培养；5）收集步骤4）中的大肠杆菌，并进行重组蛋白提取和纯化，即可得到
HPV
广谱抗原
。7.
一种基于权利要求1‑5任一项所述的新型
HPV
广谱抗原的多克隆卵黄抗体，其特征在于，所述多克隆卵黄抗体是经由所述新型
HPV
广谱抗原免疫产蛋鸡制备得到
。8.
如权利要求7所述的所述多克隆卵黄抗体的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：（1）根据所述的新型
HPV
广谱抗原的制备方法获取所述的新型
HPV
广谱抗原；（2）产蛋鸡免疫程序：初次免疫原为新型
HPV
广谱抗原
(50...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐小军，郑鸣则，张秀芳，
申请(专利权)人：尤丽康江苏生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：