一种瘀毒证膀胱癌原位荷瘤大鼠模型制备方法技术

一种瘀毒证膀胱癌原位荷瘤大鼠模型制备方法，其特征在于，在

【技术实现步骤摘要】
一种瘀毒证膀胱癌原位荷瘤大鼠模型制备方法


[0001]本专利技术涉及动物模型
，具体是一种瘀毒证膀胱癌原位荷瘤大鼠模型制备方法
。

技术介绍

[0002]膀胱癌是泌尿系统中最常见的恶性肿瘤之一，且易于复发
、
预后较差
。
膀胱癌的病因及发病机制尚不十分清楚，目前已知膀胱癌发生是多因素且复杂的病理过程，既有外在环境因素，也有内在遗传因素，较明确的致病危险因素是吸烟和长期接触工业化学类物品的职业因素
。
现如今，治疗方式西医以手术治疗为主，术后膀胱灌注药物延缓复发
。
传统中医将膀胱癌归属为“溺血
、
血尿”范畴，认为其毒邪
、
瘀血
、
痰湿贯穿疾病的始终
。
中医治疗则是在手术治疗的基础上，依据辩证论治，采用中药内服治疗，并在我们前期临床研究中取得显著的临床疗效
。
为探明其中的具体作用机理，合适的动物模型是不可或缺的
。
在现阶段药理实验研究中，膀胱癌动物模型的制备方法较多，但造模方法多以西医为指导，缺乏中医证候模型，为中医药相关研究带来局限性
。
因此需要够建立更加完善的“病”、“证”结合的动物模型以供新药研发和临床参考
。
[0003]现有的膀胱癌荷瘤大鼠模型缺乏具体的中医证候分型，无法合理诠释“病
‑
证
‑
方”基础下中医药的作用机理；现有瘀毒证动物造模方法较为单一，且病种覆盖较少，成瘤效率低，观察时间短，且缺乏膀胱癌动物模型方法，使得中医药治疗膀胱癌的药理毒理学研究缺乏可靠的模型基础；缺乏鉴定“瘀毒证膀胱癌大鼠模型”的标准流程及参考指标，对于制作出的大鼠模型无标准化的方法
。

技术实现思路

[0004]本专利技术所要解决的技术问题是提供一种瘀毒证膀胱癌原位荷瘤大鼠模型制备方法，可以有效解决上述
技术介绍
中提出的问题
。
[0005]为解决上述问题，在我们的前期研究中发现，对于瘀毒证的膀胱癌患者术后采用“活血解毒”中药内服联合膀胱灌注治疗，可以有效提高患者生活质量，抑制肿瘤的术后复发率
。
并且通过相关细胞实验研究，我们发现中药对膀胱癌的进展存在多通路多渠道的抑制作用，然后由于缺乏合适的瘀毒证膀胱癌动物模型，无法模拟中药的代谢及作用过程，阻碍了我们进一步研究的开展
。
为此，我们多方学习及考证，并通过大量前期预实验及反复模型构建，探索出一种可以稳定培养出（瘀毒证）膀胱癌大鼠模型的方法，并针对培育出的大鼠模型我们也给出了相应的鉴定方式
。
为诠释中医药在膀胱癌治疗中发挥抗肿瘤治疗的可能机制以及膀胱癌中医药协同化疗治疗提供了研究基础
。
[0006]本专利技术所采取的技术方案是：一种瘀毒证膀胱癌原位荷瘤大鼠模型制备方法，在
SD
大鼠腹腔注射
0.3ml/g
水合氯醛麻醉，起效后大鼠仰卧固定，碘伏消毒会阴部，使用导尿管从大鼠尿道外口沿后壁缓慢插入进入膀胱内抽净尿液；向大鼠膀胱内灌注
0.2mL MNU
溶液，灌注完毕后撤出导尿管，并轻柔夹闭尿道口，每2周重复灌注1次，共4次；在大鼠颈背部
1、
待大鼠适应性喂养1周后，运用
N
‑
甲基
‑
N
‑
亚硝基脲（
MNU
）柠檬酸钠溶液膀胱灌注联合肾上腺素皮下注射，连续8周，可获得瘀毒证膀胱癌大鼠模型（盐酸肾上腺素的持续皮下注射可以导致大鼠机体的血瘀表现，而
MNU
作为一种膀胱癌化学致癌剂，联合柠檬酸钠进行膀胱灌注处理，可以使得大鼠自发导致膀胱癌，并且
MNU
作为一种有毒物质，符合瘀毒证膀胱癌大鼠发病的病理过程）
。
且该种模型大鼠的中位数存活时间为
24.7
周，可以完整覆盖肿瘤治疗的全生命周期观察
。
[0018]2、
为验证瘀毒证膀胱癌大鼠模型，我们形成了系统的评价方式：采用大鼠旷场实验
、
舌质
RGB
检测实验
、
机械疼痛检测观察模型大鼠的体态表现及中医四诊变化，确定模型大鼠瘀毒证型的中医辨证特征；采用酶联免疫吸附测定（
ELISA
）检测大鼠血清中血管内皮细胞生长因子（
VEGF
）
、
内皮素
‑1（
ET
‑1）
、
一氧化氮（
NO
）
、
组织型纤溶酶原激活剂（
t
‑
PA
）
、
纤溶酶原激活物抑制因子
‑1（
PAI
‑1）
、6
酮前列腺素（6‑
keto
‑
PEGF1a
）
、
血栓素
B2
（
TXB2
）等血小板
、
血管内皮细胞功能等指标，采用凝固法检测凝血酶时间
(TT)、
凝血酶原时间
(PT)、
活化部分凝血酶原时间
(APTT)、
纤维蛋白原
(FIB)
检测凝血功能指标，用于评估瘀毒证膀胱癌大鼠的微观理化表征；采用大鼠
MRI
扫描检测造模期间大鼠膀胱原位成瘤情况；采用苏木精
‑
伊红染色（
HE
染色）观察大鼠膀胱癌组织形态
。
[0019]作为本专利技术的一个具体实施例
:
一
、
模型制备方法的步骤（1）
SPF
级
SD
雄性大鼠适应性喂养1周，实验期间自由饮水，饲固体饲料，温度 22~24℃
，湿度 40%~60%。
[0020]（2）
MNU
溶液配制：在
50℃
的水浴箱中配置，将
N
‑
甲基
‑
N
‑
亚硝基脲（
MNU
）与（
PH = 6.0
）柠檬酸钠溶液按照比例1：5混合配制成（浓度：
10mg/ml
）的混合溶液
。
[0021]（3）自发性膀胱肿瘤模型：
10%
水合氯醛（
0.3ml/g
）腹腔注射麻醉，起效后大鼠仰卧固定，碘伏消毒会阴部
。
确认并上提尿道外口，用蘸有石蜡油的自制导尿管从尿道外口沿后壁缓慢插入，插入自制大鼠导尿管约3～
4cm
后可有明显的阻碍感，表明导尿管已位于膀胱内，抽净尿液，向每只大鼠注射
MNU
溶液
0.2ml
膀胱灌注处理，灌注完毕后撤出导尿管，并本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种瘀毒证膀胱癌原位荷瘤大鼠模型制备方法，其特征在于，在
SD
大鼠腹腔注射
0.3ml/g
水合氯醛麻醉，起效后大鼠仰卧固定，碘伏消毒会阴部，使用导尿管从大鼠尿道外口沿后壁缓慢插入进入膀胱内抽净尿液；向大鼠膀胱内灌注
0.2mL MNU
溶液，灌注完毕后撤出导尿管，并轻柔夹闭尿道口，每2周重复灌注1次，共4次；在大鼠颈背部皮下注射
0.2ml
盐酸肾上腺素，每2天注射1次，连续注射8周
。2.
根据权利要求1所述的瘀毒证膀胱癌原位荷瘤大鼠模型制备方法，其特征在于，所述水合氯醛的浓度为
10%。3.
根据权利要求1所述的瘀毒证膀胱癌原位荷瘤大鼠模型制备方法，其特征在于，所述
MNU
溶液由
N
‑
甲基
‑
N
‑
亚硝基脲与柠檬酸钠溶液按照比例1：5混合配制成；所述
MNU
溶液浓度为
10mg/ml。4.
根据权利要求1所述的瘀毒证膀胱癌原位荷瘤大鼠模型制备方法，其特征在于，所述盐酸肾上腺素的浓度为
1%。5.
根据权利要求1所述的瘀毒证膀胱癌原位荷瘤大鼠模型制备方法，其特征在于，
SD
大鼠为
SPF
级
SD
雄性大鼠
。6.
根据权利要求1‑5任一项所述的瘀毒证膀胱癌原位荷瘤大鼠模型制备方法，其特征在于，还包括模型鉴定
:
对模型大鼠进行中医证型的症候评估
、
中医瘀毒证型的理化指标鉴定和膀胱癌组织鉴定；所述中医证型的症候评估包括旷场检测
、
舌质
RGB
检测和机械疼痛检测；所述中医瘀毒证型的理化指标鉴定包括凝血检测
、

【专利技术属性】
技术研发人员：沈炀，罗板鑫，叶和松，袁琳，
申请(专利权)人：南京中医药大学第二附属医院江苏省第二中医院，
类型：发明
国别省市：