一种特异性标记脂质筏区蛋白质和唾液酸的多功能邻近标记方法技术

本发明专利技术公开了一种特异性标记脂质筏区蛋白质和唾液酸的多功能邻近标记方法

【技术实现步骤摘要】
一种特异性标记脂质筏区蛋白质和唾液酸的多功能邻近标记方法、试剂盒及其应用


[0001]本专利技术涉及蛋白质工程
，具体涉及一种特异性标记脂质筏区蛋白质和唾液酸的多功能邻近标记方法
、
试剂盒及其应用
。

技术介绍

[0002]细胞膜在亚微米尺度上横向不均匀，可分为相对有序和无序两个阶段
。
其中，液体有序结构域称为脂质筏区
。
脂质筏是细胞膜上具有独特的结构和功能的亚细胞器
。
它选择性地招募特定的脂质和蛋白质来调节与其他膜成分的相互作用，并参与胞吐作用
、
胆固醇转运和信号转导
。
脂质筏的成分在癌症的发展和进展中波动很大，影响细胞增殖
、
蛋白质运输
、
粘附和凋亡
。
[0003]糖基化蛋白
(
如表皮生长因子受体
(EGFR)
，粘蛋白1和钙粘蛋白
)
，以及糖脂
(
如
GM1
，
GM2
和
GM3)
，被特异性地招募到脂质筏中，参与细胞代谢和信号转导
。
糖基化增加了蛋白质的异质性和功能多样性，特别是唾液酸化，它作为一个终止基团存在，处于许多关键细胞相互作用的前沿
。
研究发现，唾液酸化不仅影响膜蛋白在脂质筏中的分布，而且与脂质筏的组织和功能有关
。
筏上的唾液酸偶联物也可能与肿瘤发生和恶性转化密切相关，可作为肿瘤诊断和治疗的新的生物标志物
。
此外，唾液酸
(Sia)
，特别是脂质筏上的唾液酸，被认为是甲型流感病毒和
SARS
‑
CoV
‑2等病毒入侵细胞时的结合位点，脂质筏区也被认为是病毒出芽的首选区域
。
因此，迫切需要开发一种技术，能够在脂质筏的这一微观结构域的尺度上跟踪
Sia
的动态
。
此外，一个更艰巨的挑战是在脂质筏区域手动操纵
Sia
，以调节与脂质筏区域相关的细胞
‑
病毒和细胞
‑
微环境等相互作用
。
[0004]过氧化物酶
(
辣根过氧化物酶
(HRP)
，工程抗坏血酸过氧化物酶
(APEX)
，
APEX2)
可以介导含酚分子转化为高活性的苯氧自由基，这些自由基可以共价结合到富含电子的氨基酸，如邻近蛋白质中的酪氨酸
。
这些自由基的寿命短
(<1ms),
标记半径小
(<20nm)
，满足了脂质筏特异性标记的需要
。
结合蛋白质组学，过氧化物酶介导的邻近标记为空间蛋白质组学提供了强有力的工具
。
从另一个角度来看，利用生物正交反应结合荧光或功能分子，过氧化物酶介导的邻近标记策略为空间特异性的分子跟踪和工程化奠定了基础
。
[0005]基于生物素与
(
链霉
)
亲和素的结合具有特异性高
、
亲和力强的特点，生物素
‑
亲和素这一生物反应放大系统在生物医学领域有着极为广泛的应用，如蛋白质印迹
(Westernblot)、
酶联免疫吸附实验
(ELISA)
检测或亲和层析等
。
使用生物素连接酶的标记系统存在反应时间过长，无法获得某个较短时间内的相互作用关系，并且无法标记膜受限区域等问题，因此过氧化物酶被尝试用于活细胞中蛋白质的邻近标记
。
辣根过氧化物酶
(HRP)
最早被用于邻近蛋白质标记，富含电子氨基酸的蛋白质是过氧化物酶介导的邻近标记的天然底物，但
Sia
不是
HRP
介导标记的底物，现有技术也不能很好地解决这一问题，为了实现脂质筏特异性蛋白和
Sia
的多重标记，开发肿瘤诊断和治疗的新的生物标志物，采用一种创新的化学转化反应，将
Sia
转化为
HRP
的标记底物就显得尤为重要
。

技术实现思路

[0006]针对上述现有技术，本专利技术的目的是提供一种特异性标记脂质筏区蛋白质和唾液酸的多功能邻近标记方法
、
试剂盒及其应用
。
本专利技术开发一种多功能邻近标记
(MLP)
策略，不仅可以同时对脂质筏进行蛋白质和
Sia
标记，还可以操纵脂质筏特异性
Sia。
霍乱毒素
B
亚单位
(CTxB)
被认为是鉴定脂质筏的金标准，本专利技术使用
HRP
偶联
CTxB
作为催化标记模块，制备了用于脂质筏的多功能标记探针
。
本专利技术引入了一种创新的化学转化反应，将
Sia
转化为
HRP
的标记底物，含有不同功能模式的苯酚分子依次标记在筏特异性蛋白和
Sia
上
。
该方法原位跟踪脂质筏特异性蛋白和
Sia
的动态
。
有趣的是，通过结合含
Sia
分子的点击反应，该方法实现了筏特异性梯度
Sia
工程
。
因此，本专利技术为调控脂质筏特异性
Sia
和开发基于脂质筏的肿瘤治疗方案提供了巨大的机会
。
[0007]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0008]本专利技术的第一方面，提供一种特异性标记脂质筏区蛋白质
、
唾液酸的多功能邻近标记试剂盒，所述多功能邻近标记试剂盒包括：
HRP
‑
CTxB
偶联物探针，用于对脂质筏区蛋白质进行特异性标记的标记试剂二苯基环辛烷
‑
苯酚
DP
，用于将唾液酸的
C7位点氧化为醛基的氧化剂
NaIO4，用于与唾液酸的氧化醛基发生正交反应的正交试剂酰肼
‑
苯酚
HP
，用于对脂质筏特异性唾液酸进行标记的标记试剂生物素
‑
苯酚
BP。
[0009]进一步的，所述
HRP
‑
CTxB
偶联物探针由辣根过氧化物酶和霍乱毒素
B
亚单位偶联制得
。
[0010]本专利技术的第二方面，提供一种所述多功能邻近标记试剂盒采用的特异性标记脂质筏区蛋白质
、
唾液酸的邻近标记方法，所述邻近标记方法包括如下步骤：
[0011](1)
制备
HRP
‑
CTxB
偶联物探针本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种特异性标记脂质筏区蛋白质
、
唾液酸的多功能邻近标记试剂盒，其特征在于，所述多功能邻近标记试剂盒包括：
HRP
‑
CTxB
偶联物探针，用于对脂质筏区蛋白质进行特异性标记的标记试剂二苯基环辛烷
‑
苯酚
DP
，用于将唾液酸的
C7位点氧化为醛基的氧化剂
NaIO4，用于与唾液酸的氧化醛基发生正交反应的正交试剂酰肼
‑
苯酚
HP
，用于对脂质筏特异性唾液酸进行标记的标记试剂生物素
‑
苯酚
BP。2.
根据权利要求1所述多功能邻近标记试剂盒，其特征在于，所述
HRP
‑
CTxB
偶联物探针由辣根过氧化物酶和霍乱毒素
B
亚单位偶联制得
。3.
利用权利要求1‑2任一项所述多功能邻近标记试剂盒进行特异性标记脂质筏区蛋白质
、
唾液酸的邻近标记方法，其特征在于，所述邻近标记方法包括如下步骤：
(1)
制备
HRP
‑
CTxB
偶联物探针；以作为识别蛋白的霍乱毒素
B
亚单位
CTxB
修饰辣根过氧化物酶
HRP
制得
HRP
‑
CTxB
偶联物探针；
(2)
对脂质筏区蛋白质进行特异性标记；使用二苯基环辛烷
‑
苯酚
DP
对脂质筏特异性蛋白进行标记；
(3)
对脂质筏区唾液酸
Sia
进行特异性标记；使用
NaIO4将唾液酸的
C7位点氧化为醛基，氧化的醛基与酰肼
‑
苯酚
HP
发生正交反应，使用生物素
‑
苯酚
BP
对脂质筏特异性唾液酸进行标记
。4.
根据权利要求3所述的邻近标记方法，其特征在于，步骤
(1)
中，制备方法具体为：将
10
～
30mM
的
NalO4与1～
5mg/mLHRP
的水溶液在室温下避光震荡
10
～
30
分钟，去除未反应的
NalO4，调整反应液的
pH
至9～
10
，加入1～
5mg CTxB
，室温下避光反应1～2小时，将1～
4mg/ml NaBH4液注入反应液，即可获得
HRP
‑
CTxB
偶联物探针
。5.
根据权利要求3所述的邻近标记方法，其特征在于，步骤
(2)
中，特异性标记方法具体为：向细胞中加入
100
μ
L 1
～5μ
g/mL HRP
‑
CTxB
在
4℃
下孵育
30min
，加入
100
μ
L
含
100
～
200
μ
M DP
和
100
～
400
μ
M H2O2的
PBS
，加入
10
μ
L
含有
100
～
200mM NaN3和
100
～
200mM
抗坏血酸钠的
PBS
，完成脂质筏特异性蛋白的标记
。6.
根据权利要求3所述的邻近标记方法，其特征在于，步骤
(3)
中，特异性标记方法具体为：向步骤
(2)
中细胞加入
100
μ
L 1
～
5mM NaIO4，在
4℃
下孵育
10
～
30
分钟，向细胞中加入
100
μ
L
含有
10
～
50mM

【专利技术属性】
技术研发人员：郭玉娜，沈亮，尹华美，郑磊，
申请(专利权)人：山东第一医科大学山东省医学科学院，
类型：发明
国别省市：