牛奶中四环素类兽药残留的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种牛奶中四环素类兽药残留的检测方法

【技术实现步骤摘要】
牛奶中四环素类兽药残留的检测方法


[0001]本专利技术涉及食品检测
，具体的说是一种牛奶中四环素类兽药残留的检测方法，基于核酸适配体
‑
胶体金技术
。

技术介绍

[0002]现行国标方法
《GB/T 21317
‑
2007》
动物源性食品中四环素类兽药残留量检测方法 液相色谱
‑
质谱
/
质谱法与高效液相色谱法，检测通过液相
‑
质谱联用仪的方法检测四环素，方法需使用大量有机溶剂
、
前处理过程繁复
、
需耗费大量物力
、
人力
。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的是提供一种牛奶中四环素类兽药残留的检测方法，基于核酸适配体
‑
胶体金技术，能够快速高效的实现对牛奶中四环素类兽药残留的检测
。
[0004]为实现上述目的，本专利技术所采取的技术方案为：一种牛奶中四环素类兽药残留的检测方法，包括以下步骤：
S1、
制备粒径均一
、
状态稳定的胶体金：将
100mL
质量百分比含量为
0.01%
氯金酸溶液置于磁力加热搅拌器上，煮沸
2min
，加入质量百分比含量为
1%
的柠檬酸三钠水溶液
2mL
，继续搅拌加热，溶液变成酒红色后持续加热
10min
，停止加热，冷却至室温，
4℃
保存备用；将胶体金溶液用光度计在
400
‑
800nm
波长范围进行扫描，确定其最大吸收峰波长为
530nm
；
S2、
核酸适配体的特异性测定：选择浓度均为
20
μ
g/L
四环素溶液
、
土霉素溶液
、
多西环素溶液
、
土霉素溶液分别加入四环素核酸适配体，使其终浓度为
150nmol/L
：加入
S1
制备好的胶体金溶液
2mL
，室温反应
5min
，然后加入
100
μ
L
的
NaCl
溶液使其终浓度为
40mmol/L
，观察颜色变化，同时设置空白对照，发现
20
μ
g/L
四环素溶液体系无明显颜色变化，其他均变为蓝紫色，说明其他体系中缺少核酸适配体对胶体金的稳定作用，使得胶体金溶液凝聚变色，说明序列2与四环素之间能够特异性结合；
S3、
建立基于核酸适配体
‑
胶体金的牛奶中四环素兽药残留的检测方法：于
10mL
比色管中加入一定量的四环素储备液，配制终浓度分别为5μ
g/L、8
μ
g/L 、10
μ
g/L、16
μ
g/L、20
μ
g/L、40
μ
g/L、50
μ
g/L
四环素标准曲线溶液：加入四环素核酸适配体使其终浓度为
150nmol/L
：加入步骤
S1
制备好的胶体金溶液
2mL
，室温反应
5min
，然后加入
100
μ
L
的
NaCl
溶液使溶液的终浓度为
40 mmol/L
，用水定容，用紫外可见分光光度计测定溶液在
650nm
的
A
650nm
值和
530nm
的
A
530nm
值，以
A
650nm
/A
530nm
的比值为纵坐标，四环素的浓度为横坐标，绘制标准曲线；
S4、
建立测定牛奶中四环素类兽药残留的前处理方法：取
2mL
牛奶，加入甲醇和乙腈的混合提取液
2mL
，离心，取上清液
0.5mL
，于
10mL
比色管中加入四环素核酸适配体，使其终浓度为
150nmol/L
：加入步骤
S1
制备好的胶体金溶液
2mL
，室温反应
5min
，然后加入
100
μ
L
的
NaCl
溶液使其终浓度为
40mmol/L
，用水定容，用紫外可见分光光度计测定溶液在
650nm
的
A
650nm
值和
530nm
的
A
530nm
值的比值，计算出浓度；
S5、
牛奶中四环素兽药残留的线性范围
、
检出限
、
回收率及精密度实验：
（1）线性范围用紫外可见分光光度计测定溶液在
650nm
的
A
650nm
值和
530nm
的
A
530nm
值，以
A
650nm
/A
530nm
的比值为纵坐标，四环素的浓度为横坐标，绘制标准曲线
,
可以获得方程式和
R
值；（2）回收率空白牛奶基质中分别添加终浓度为
10
μ
g/L、25
μ
g/L、40
μ
g/L
的四环素，每个浓度设置个平行，按照已经优化的方法对牛奶样品进行前处理，所得溶液按照已优化的方法进行检测，将测得的吸光度值代入标准曲线，计算四环素回收率；
S6、
通过液相
‑
三重四级杆质谱联用仪测定四环素含量，验证结果是否与基于核酸适配体
‑
胶体金的牛奶中四环素兽药残留的检测方法测定结果一致；全面分析核酸适配体
‑
胶体金的牛奶中四环素兽药残留的检测方法的可信性与可行性
。
[0005]优选的，所述步骤
S2
中四环素核酸适配体浓度的优化：核酸适配体浓度过高会影响灵敏度
、
过低则无法保护胶体金，选择终浓度分别为
50nmol/L、100nmol/L、150nmol/L、200nmol/L、400nmol/L
的核酸适配体，与
S1
制备的胶体金溶液反应，室温下反应
5min
，后加入
NaCl
溶液，使反应液的终浓度为
40 mmol/L
，选择胶体金仍保持红色的为最佳条件，通过实验发现，当适配体浓度为
50nmol/L
时胶体金溶液本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种牛奶中四环素类兽药残留的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、
制备粒径均一
、
状态稳定的胶体金：将
100mL
质量百分比含量为
0.01%
氯金酸溶液置于磁力加热搅拌器上，煮沸
2min
，加入质量百分比含量为
1%
的柠檬酸三钠水溶液
2mL
，继续搅拌加热，溶液变成酒红色后持续加热
10min
，停止加热，冷却至室温，
4℃
保存备用；将胶体金溶液用光度计在
400
‑
800nm
波长范围进行扫描，确定其最大吸收峰波长为
530nm
；
S2、
核酸适配体的特异性测定：选择浓度均为
20
μ
g/L
四环素溶液
、
土霉素溶液
、
多西环素溶液
、
土霉素溶液分别加入四环素核酸适配体，使其终浓度为
150nmol/L
：加入
S1
制备好的胶体金溶液
2mL
，室温反应
5min
，然后加入
100
μ
L
的
NaCl
溶液使其终浓度为
40mmol/L
，观察颜色变化，同时设置空白对照，发现
20
μ
g/L
四环素溶液体系无明显颜色变化，其他均变为蓝紫色，说明其他体系中缺少核酸适配体对胶体金的稳定作用，使得胶体金溶液凝聚变色，说明序列2与四环素之间能够特异性结合；
S3、
建立基于核酸适配体
‑
胶体金的牛奶中四环素兽药残留的检测方法：于
10mL
比色管中加入一定量的四环素储备液，配制终浓度分别为5μ
g/L、8
μ
g/L 、10
μ
g/L、16
μ
g/L、20
μ
g/L、40
μ
g/L、50
μ
g/L
四环素标准曲线溶液：加入四环素核酸适配体使其终浓度为
150nmol/L
：加入步骤
S1
制备好的胶体金溶液
2mL
，室温反应
5min
，然后加入
100
μ
L
的
NaCl
溶液使溶液的终浓度为
40 mmol/L
，用水定容，用紫外可见分光光度计测定溶液在
650nm
的
A
650nm
值和
530nm
的
A
530nm
值，以
A
650nm
/A
530nm
的比值为纵坐标，四环素的浓度为横坐标，绘制标准曲线；
S4、
建立测定牛奶中四环素类兽药残留的前处理方法：取
2mL
牛奶，加入甲醇和乙腈的混合提取液
2mL
，离心，取上清液
0.5mL
，于
10mL
比色管中加入四环素核酸适配体，使其终浓度为
150nmol/L
：加入步骤
S1
制备好的胶体金溶液
2mL
，室温反应
5min
，然后加入
100
μ
L
的
NaCl
溶液使其终浓度为
40mmol/L
，用水定容，用紫外可见分光光度计测定溶液在
650nm
的
A
650nm
值和
530nm
的
A
530nm
值的比值，计算出浓度；
S5、
...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯翀，王小乔，许晓辉，张兰，潘秀丽，
申请(专利权)人：兰州市食品药品检验检测研究院，
类型：发明
国别省市：