狐米草低能重离子辐射诱变育种方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域。通过低能重离子辐照狐米草胚性愈伤组织，导致胚性细胞遗传物质的突变，受辐射材料分化形成的再生苗在气候人工控制的封闭温室中长大后，经过生物量、粗蛋白含量等１０项性状指标的检测，筛选出品质明显改良的株系，在此基础上再比较ＤＮＡ变异情况，最终筛选到品质性状明显改善并且遗传基础已经发生变异，能够稳定遗传的优质新品系。为滨海滩涂牧场建设和湿地恢复提供优良种质资源。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，涉及一种利用低能重离子辐射诱变选育狐米草优质新品系的方法。狐米草在中国引种始于上世纪80年代，国内品种单一，且至今没有其遗传育种方面的报道。以往离子束辐射诱变育种的报道都集中在作物种子和微生物，而未见于植物胚性愈伤组织。美国特拉华大学的盐生植物生物技术中心，首次进行了狐米草组织培养方面的研究，并发表论文一篇(Xianggan Li et al.，1995.Plantregeneration from callus cultures of salt marsh hay，Spartina patens，and itscellular-based salt tolerance.Aquatic botany 51，103-113)，但未报道其再生效率。本方法专利技术人及合作者也曾就狐米草组织培养发表两篇文章(蔡小宁等，2000.狐米草离体培养植株再生.江苏农业学报16(3)，143-147；Zhou Lu et al.，2003.Effect of brassinolide on callus growth and regeneration in Spartina patens(Poaceae).Plant cell，tissueand organ culture 73，87-89)，并申请了实验室大规模生产狐米草再生苗的技术专利(专利号00112526.5)。但所有工作均未涉及狐米草遗传改良和新优品系的筛选，而且所用组织培养技术操作复杂、试剂浪费。本项工作的关键是从大量愈伤组织中获得胚性个体。在光照条件下，部分组织(5％左右)在生长初期出现绿色颗粒，立即将其与周围白色组织小心分离并单独培养，在以后一个月内，一发现白色组织，即立刻切除。两个月后，将其它并未转绿的组织块全部清除。绿色致密组织即胚性愈伤组织，在新的激素配比下继代，每月更换一次培养基，材料即以1∶8的比例迅速扩繁。本方法中所用愈伤组织诱导与胚性材料继代培养基的基本成分均为MS基本元素(Sigma成品)4.6g/L+蔗糖30g/L+Phytagel琼脂糖2g/L激素配比分别为诱导培养基2，4-D2.0mg/L+IAA 1.0mg/L继代培养基NAA 1.0mg/L+2，4-D0.5mg/L+BA 0.5mg/L2.低能重离子辐射将胚性愈伤组织从继代培养基上取出，在2％灭菌的DMSO水溶液中浸泡45min，在超净工作室内晾去表面水迹，之后放入离子束注入机靶室中。以能量为20KeV，剂量范围为2.6×1015ions cm-2到15.6×1015ions cm-2的N+辐射材料。注入机每工作10s，间息10s。注入前靶室须抽真空。辐射后的材料重新接到继代培养基上恢复3个月，约27.4％的组织能够存活。3.组织分化与幼苗的生长将辐射后恢复生长的胚性愈伤组织接入芽分化培养基，待幼芽长至4cm高以上时将其从组织块上切下，接入根分化培养基。剩余的组织块可继续诱导新芽。本方法中采用的芽分化培养基基本成分同前，激素为BA 3mg/L；根分化培养基基本成分改为2.3g/L+蔗糖15g/L+Phytagel琼脂糖2g/L，不另加激素。当根长至1cm以上时，即可将幼苗移栽到气候可人工控制的封闭温室中。苗床基质以锯木屑与碳渣(10∶1)为主。幼苗栽种密度为15株/m2。以人工方式每周浇灌一次改进的Hoagland营养液或人工海水，平时以自动滴灌自来水保持基质湿润。温室中夏季(6～8月)日最高温平均34.5℃，日最高光照强度平均583.9μmols-1m-2；冬季(12～2月)日最低温平均5.7℃，日最高光照强度平均217.5μmols-1m-2；年平均湿度72.7％。改进的Hoagland营养液和人工海水配方为 运用本方法，每块反绿的胚性愈伤组织可以分化出3～4批幼苗，共计30株左右。幼苗在苗床上成活率达95％以上。4.植株品质性状比较与DNA检测在苗床上生长3个月以后，分别测定每株再生苗的株高、节间距、叶长、叶宽、茎粗、分蘖数、地上生物量、地下生物量、地上/地下生物量之比、粗蛋白含量等品质性状指标，并用单因素方差分析与未经辐射愈伤组织形成的原始再生苗相关数据进行对照。对发生正向变异的样本标记，用CTAB法提取DNA，用Operon引物A18，A10，A4，A3，Bi0，C2，C11，D7对每个标记样本进行RAPD扩增，比较DNA变异情况。经过本方法中N+辐射处理后，约73.7％的再生植株能检测到品质指标的差异，其中正向变异占1/3。在出现正向变异的样本中又有64.9％左右的植株发生DNA的变异(约占总数的15.1％)。5.将品质明显改良并且DNA也发生变异的植株移栽入新的苗床，作为新的种质资源保存。本专利技术的效果在于1)首次建立了一套完整的狐米草诱变育种程序。2)在愈伤组织继代中，白色非胚性组织被彻底剔除。已有实验证明占据多数的白色组织分化再生能力极差，基本没有利用价值。仅扩繁绿色胚性组织可以大大节省劳动力和试剂，且因绿色组织不存在粘液化、褐化等问题，有利于操作简单化。较以往培养基配方，在继代培养基中省去了椰子汁，在芽分化培养基中省去了IAA，在根分化培养基中省去了全部激素和活性炭，且基本元素和蔗糖也减少了一半。改变后的配方对胚性愈伤组织生长没有影响，但可以简化操作和节省试剂。3)将植物胚性愈伤组织作为低能重离子辐射的受体，该材料分裂旺盛，对辐射较休眠的种子更加敏感，容易产生突变。4)再生苗栽种于相对封闭的温室中，光照、气温、湿度等气候因子可人工控制，可尽量减少环境因子对植株生长发育的影响。5)能量为20KeV，剂量范围为2.6×1015ions cm-2到15.6×1015ions cm-2的N+辐射对狐米草胚性愈伤组织诱变突变率很高，同时通过将再生苗各品质性状进行量化比较，容易发现细微的差异，能够为狐米草遗传育种准备大量突变材料。本项专利技术能够在较短时间内为滨海滩涂牧场建设和湿地恢复提供优良种质资源。具体实施例方式实例1.取狐米草种子100颗，切除非胚端后萌发，共获得61株幼苗。取无菌幼苗茎基部在含有MS基本元素4.6g/L、蔗糖30g/L、2，4-D2.0mg/L、IAA1.0mg/L和Phytagel琼脂糖2g/L的诱导培养基上诱导出愈伤组织，并从中分离出绿色胚性组织4份，放入含有MS基本元素4.6g/L、蔗糖30g/L、NAA 1.0mg/L、2，4-D0.5mg/L、BA0.5mg/L和Phytagel琼脂糖2g/L的继代培养基上培养。扩繁到一定数量后，从中选出20块组织浸入2％DMSO溶液45min，晾去表面水迹后施以能量为20KeV，剂量为10.4×1015ions cm-2的N+辐射。恢复培养3个月后，6块组织存活。将之转入含MS基本元素4.6g/L、蔗糖30g/L、BA3mg/L和Phytagel琼脂糖2g/L的芽分化培养基上诱导出芽，再将芽切下，转到含MS基本元素2.3g/L、蔗糖15g/L和Phytagel琼脂糖2g/L的根分化培养基上诱导出根。总计获得再生苗150多株。在南京大学智能温室中生长3个月后进行品质分析，发现有92株出现了一项或多项指标变异，其中正向变异样本29株，而正向变异样本中又有19个样本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种狐米草诱变育种的方法，其特征是利用能量为２０ＫｅＶ，剂量范围为２．６×１０↑［１５］ｉｏｎｓ ｃｍ↑［－２］到１５．６×１０↑［１５］ｉｏｎｓ ｃｍ↑［－２］的Ｎ↑［＋］辐照狐米草胚性愈伤组织，诱导胚性细胞产生突变，在分化形成的再生苗中，筛选品质性状改良并且遗传物质已经发生改变，能够稳定遗传的新优品系，其技术方法为：（１）将狐米草种子非胚端切除以提高种子萌发率，在改良的继代培养基上仅扩繁狐米草胚性愈伤组织；（２）以能量为２０ＫｅＶ，剂量范围为２．６×１０↑［１５］ ｉｏｎｓ ｃｍ↑［－２］到１５．６×１０↑［１５］ｉｏｎｓ ｃｍ↑［－２］的Ｎ↑［＋］辐照狐米草胚性愈伤组织，诱导产生胚性细胞的突变；（３）在改良的分化培养上，从受辐射后恢复活力的胚性愈伤组织上分化获得再生苗，并栽种于环境相对封闭，光照 、气温、湿度等气候因子人为控制的温室中；（４）检测再生植株株高、节间距、叶长、叶宽、茎粗、分蘖数、地上生物量、地下生物量、地上／地下生物量之比以及粗蛋白含量，筛选品质性状改良的株系；（５）在品质改良的株系中，用ＲＡＰＤ检测ＤＮＡ，筛 选遗传物质已经发生变异，能够稳定遗传的新优品系。...

【技术特征摘要】
1.一种狐米草诱变育种的方法，其特征是利用能量为20KeV，剂量范围为2.6×1015ions cm-2到15.6×1015ions cm-2的N+辐照狐米草胚性愈伤组织，诱导胚性细胞产生突变，在分化形成的再生苗中，筛选品质性状改良并且遗传物质已经发生改变，能够稳定遗传的新优品系，其技术方法为(1)将狐米草种子非胚端切除以提高种子萌发率，在改良的继代培养基上仅扩繁狐米草胚性愈伤组织；(2)以能量为20KeV，剂量范围为2.6×1015ions cm-2到15....

【专利技术属性】
技术研发人员：钦佩，周长芳，朱晓佳，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]