一种节瓜抗枯萎病变异体的离体筛选方法技术

本发明专利技术公开了一种节瓜抗枯萎病变异体的离体筛选方法，包括以下步骤：（１）以节瓜种子灭菌后接种于基本培养基中形成无菌苗，切取无菌苗茎尖，转接入不定芽分化培养基使之形成丛生不定芽，此不定芽可以在不定芽分化培养基上反复继代培养，扩大繁殖，建立节瓜无性繁殖系；（２）用镰刀菌酸作为离体胁迫剂与所述节瓜不定芽分化培养基配制筛选培养基，对已建立的节瓜无性繁殖系进行抗性离体筛选，获得具有对镰刀菌酸抗性的无性繁殖系；（３）将具有抗性的无性繁殖系的不定芽切下，在生根培养基上诱导生根，形成再生植株，即为抗性变异体。本发明专利技术不仅筛选出的变异体抗性强，而且选择效率高，选择效果好。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种节瓜抗枯萎病变异体的离体筛选方法。
技术介绍
节瓜是华南地区有优势的特色蔬菜，节瓜枯萎病是节瓜的主要病害之一，给节瓜生产造成严重损失。由于枯萎病菌在土壤中存活时间可达3年以上，通过轮作等栽培措施难以从根本上消除病害的影响。选育节瓜抗枯萎病品种是解决节瓜枯萎病危害问题的根本途径。由于节瓜遗传资源比较狭窄，目前节瓜种质资源中抗枯萎病材料较为缺乏，已成为节瓜抗枯萎病育种的瓶颈。节瓜枯萎病是由镰刀菌属病菌引起的真菌性病害。镰刀菌侵入植物体内，可以分泌毒素镰刀菌酸，对寄主植物产生毒害，使后者枯萎，直至死亡。常规的抗枯萎病材料筛选的方法是田间自然筛选或苗期人工接种筛选。田间自然筛选在病害自然发生时，在田间感病群体中选择发病轻或未发病的个体进行繁殖，以获得抗病材料；这种方法的缺点是依赖于病害的自然发生，病害轻的年份无法开展工作；苗期人工接种筛选是在苗期将人工培养的病菌接种到植株上，待群体发病时，从中选取未发病或发病轻的个体进行培育，繁殖，进而获得抗病植株；这种方法可以克服对病害自然发生的依赖，但仍会受季节限制，必须在适宜发病的季节进行接种鉴定，选择效率相对较低，同时如果群体较小，或群体中变异较少，也难以达到预期的选择效果。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种选择效率高，选择效果好的节瓜抗枯萎病变异体的离体筛选方法。本专利技术的目的可通过以下的技术步骤来实现(1)以节瓜种子灭菌后接种于1/2MS基本培养基中形成无菌苗，切取无菌苗茎尖，转接入不定芽分化培养基使之形成丛生不定芽，此不定芽可以在不定芽分化培养基上反复继代培养，扩大繁殖，建立节瓜无性繁殖系；(2)用镰刀菌酸作为离体胁迫剂与所述节瓜不定芽分化培养基配制筛选培养基，对已建立的节瓜无性繁殖系进行抗性离体筛选，获得具有对镰刀菌酸抗性的无性繁殖系；(3)将具有抗性的无性繁殖系的不定芽切下，在生根培养基上诱导生根，形成再生植株，即为抗性变异体。本专利技术步骤(1)中的不定芽分化培养基由MS基本培养基中加入6-苄基腺嘌呤至4～6mg/L，吲哚乙酸至0.1～0.2mg/L配制而成，无菌苗茎尖在不定芽分化培养基中培养18～22天，培养条件为室温23℃～27℃，每日光照10～14小时。本专利技术步骤(2)中的筛选培养基是在所述不定芽分化培养基中加入经过滤灭菌的镰刀菌酸溶液，使之最终镰刀菌酸浓度为75～100mg/L。本专利技术步骤(2)中的具体筛选过程为将继代1～2次的节瓜不定芽接种至筛选培养基中，在25±2℃，每日光照10～14小时的条件下进行培养，15～18天后将尚存活的不定芽转入不定芽分化培养基上进行恢复培养，由此不定芽分化增殖所获得的无性繁殖系具有对镰刀菌酸的抗性。本专利技术步骤(3)中的生根培养基由MS基本培养基加入吲哚乙酸至0.3～0.8mg/L而成。选用广东地方品种“黑毛节瓜”无菌苗增殖的不定芽，以镰刀菌酸浓度为75mg/L～100mg/L筛选培养基筛选的变异体经3代恢复和增殖，回接到含镰刀菌酸浓度为50～100mg/L的筛选培养基上再次筛选，以同源的未经筛选的细胞系为对照。表1结果表明，变异体对镰刀菌酸(FA)的抗性明显增强。表1经筛选的细胞系对FA抗性的提高 本专利技术与现有技术相比，具有以下的优点1、田间自然筛选方法应用的前提是田间必须有节瓜枯萎病发生，同时发病群体的大小、病害发生的严重程度均会影响选择效果；抗枯萎病变异体离体筛选在离体外加胁迫的条件下进行筛选，胁迫压力可以人工控制，不受自然气候条件及病害是否发生的限制，并且可以连续进行胁迫，可以更快地筛选出具有强抗性的材料。2、与苗期人工接种筛选方法相比，抗枯萎病变异体离体筛选在无菌条件下进行培养，不仅可以节省土地，还可以避免因人工接种不慎而导致病菌污染环境。3、田间自然筛选方法与苗期人工接种筛选方法受季节和温度影响，每年通常只能在适宜节瓜生长的季节进行筛选；而抗枯萎病变异体离体筛选在人工控制光温条件下进行，不受季节和气候的限制，筛选工作可以连续进行，显著提高了选择效率。4、田间自然筛选方法与苗期人工接种筛选方法均是在植株个体水平进行抗性筛选，而抗枯萎病变异体离体筛选方法是在组织和细胞水平进行抗性筛选，选择群体大，且与种子形成的群体相比无性繁殖系群体的变异幅度较大，因而目标性状出现的几率较大，可以获得更好的选择效果。具体实施例方式实施例一(1)将MS基本培养基中的各组分的浓度减半配制得到1/2MS培养基；以节瓜种子灭菌后接种于1/2MS培养基中形成无菌苗，切取无菌苗茎尖；(2)在MS基本培养基中加入6-苄基腺嘌呤至5mg/L，吲哚乙酸至0.1mg/L配制成不定芽分化培养基，将步骤(1)中切取的无菌苗茎尖转接入不定芽分化培养基使之形成丛生不定芽，无菌苗茎尖在不定芽分化培养基中培养20天，培养条件为室温25℃，每日光照12小时；此不定芽可以在不定芽分化培养基上反复继代培养，扩大繁殖，建立节瓜无性繁殖系；(3)在所述不定芽分化培养基中加入经过滤灭菌的镰刀菌酸溶液(Fusaric Acid，简称FA)至85mg/L配成筛选培养基，对步骤(2)中已建立的节瓜无性繁殖系进行抗性离体筛选，具体筛选过程为将继代1～2次的节瓜不定芽接种至筛选培养基中，在25℃，每日光照12小时的条件下进行培养，16天后将尚存活的不定芽转入不定芽分化培养基上进行恢复培养，由此不定芽分化增殖所获得的无性繁殖系具有对镰刀菌酸的抗性；(4)在MS基本培养基加入吲哚乙酸至0.6mg/L配成生根培养基，将上述具有抗性的无性繁殖系的不定芽切下，在生根培养基上诱导生根，形成再生植株，即为抗性变异体。实施例二(1)将MS基本培养基中的各组分的浓度减半配制得到1/2MS培养基；以节瓜种子灭菌后接种于1/2MS培养基中形成无菌苗，切取无菌苗茎尖； (2)在MS基本培养基中加入6-苄基腺嘌呤至4mg/L，吲哚乙酸至0.2mg/L配制成不定芽分化培养基，将步骤(1)中切取的无菌苗茎尖转接入不定芽分化培养基使之形成丛生不定芽，无菌苗茎尖在不定芽分化培养基中培养18～22天，培养条件为室温23℃，每日光照10小时；此不定芽可以在不定芽分化培养基上反复继代培养，扩大繁殖，建立节瓜无性繁殖系；(3)在所述不定芽分化培养基中加入经过滤灭菌的镰刀菌酸溶液(Fusaric Acid，简称FA)至75mg/L配成筛选培养基，对步骤(2)中已建立的节瓜无性繁殖系进行抗性离体筛选，具体筛选过程为将继代1～2次的节瓜不定芽接种至筛选培养基中，在23℃，每日光照10小时的条件下进行培养，15天后将尚存活的不定芽转入不定芽分化培养基上进行恢复培养，由此不定芽分化增殖所获得的无性繁殖系具有对镰刀菌酸的抗性；(4)在MS基本培养基加入吲哚乙酸至0.3mg/L配成生根培养基，将上述具有抗性的无性繁殖系的不定芽切下，在生根培养基上诱导生根，形成再生植株，即为抗性变异体。实施三(1)将MS基本培养基中的各组分的浓度减半配制得到1/2MS培养基；以节瓜种子灭菌后接种于1/2MS培养基中形成无菌苗，切取无菌苗茎尖；(2)在MS基本培养基中加入6-苄基腺嘌呤至6mg/L，吲哚乙酸至0.1mg/L配制成不定芽分化培养基，将步骤(1)中切取的无菌苗茎尖转接入不定芽分化培养基使之形成丛生不定芽，无菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种节瓜抗枯萎病变异体的离体筛选方法，其特征在于包括以下步骤：（１）以节瓜种子灭菌后接种于１／２ＭＳ基本培养基中形成无菌苗，切取无菌苗茎尖，转接入不定芽分化培养基使之形成丛生不定芽，此不定芽可以在不定芽分化培养基上反复继代培养，扩大 繁殖，建立节瓜无性繁殖系；（２）用镰刀菌酸作为离体胁迫剂与所述节瓜不定芽分化培养基配制筛选培养基，对已建立的节瓜无性繁殖系进行抗性离体筛选，获得具有对镰刀菌酸抗性的无性繁殖系；（３）将具有抗性的无性繁殖系的不定芽切下，在生根 培养基上诱导生根，形成再生植株，即为抗性变异体。

【技术特征摘要】
1.一种节瓜抗枯萎病变异体的离体筛选方法，其特征在于包括以下步骤(1)以节瓜种子灭菌后接种于1/2MS基本培养基中形成无菌苗，切取无菌苗茎尖，转接入不定芽分化培养基使之形成丛生不定芽，此不定芽可以在不定芽分化培养基上反复继代培养，扩大繁殖，建立节瓜无性繁殖系；(2)用镰刀菌酸作为离体胁迫剂与所述节瓜不定芽分化培养基配制筛选培养基，对已建立的节瓜无性繁殖系进行抗性离体筛选，获得具有对镰刀菌酸抗性的无性繁殖系(3)将具有抗性的无性繁殖系的不定芽切下，在生根培养基上诱导生根，形成再生植株，即为抗性变异体。2.根据权利要求1所述的节瓜抗枯萎病变异体的离体筛选方法，其特征在于步骤(1)中的不定芽分化培养基由MS基本培养基中加入6-苄基腺嘌呤至4～6mg/L，吲哚乙酸至0.1～0.2mg/L配制而成，无菌苗茎尖在不定芽分化培养基中培...

【专利技术属性】
技术研发人员：何晓明，谢大森，彭庆务，
申请(专利权)人：广东省农业科学院蔬菜研究所，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]